类器官的研究现状及其作为临床前模型的应用

郭正昌 综述 周 波 审校

哺乳动物的干细胞具有自组织能力，在体外对干细胞进行培养可得到具有三维构象的培养物。近年来对干细胞生长微环境有了进一步认识，2009年Sato et al[1]通过在基质胶中培养富含亮氨酸重复序列G-蛋白偶联受体5(LGR5)基因表达的肠道干细胞率先完成小肠类器官的体外构建。随后视网膜、大脑、肝、肾等类器官相继诞生。其基本原理是按照特定的时间添加干细胞生长所需的多种诱导因子，使具有分化潜能的细胞自发分化成相应的类器官。类器官可以在体外培养体系中广泛扩增并且能够长期保持生理及遗传信息的稳定[2-4]，类器官的组织可来源于患者，因此在作为临床前模型方面有着独到的优势。该文综述了几种体外培养体系成熟的类器官的研究现状及其作为临床前模型的应用。

1 成体干细胞构建类器官

成体干细胞位于分化成熟的组织器官之中，分离的成体干细胞在添加适当细胞因子的体外培养体系中可以诱导成相应的类器官。

1.1 小肠类器官Sato et al[1]在前人对肠道干细胞生长微环境研究的基础上，分离肠道隐窝，在富含层黏连蛋白的基质胶中培养LGR5基因表达的肠道干细胞，待基质胶完全聚合后，加入干细胞增殖、分化所需的R脊椎蛋白1、表皮生长因子和头蛋白等细胞因子。在这个体外培养系统中成功的培养出了具有隐窝-绒毛结构的小肠上皮即小肠类器官，经过验证，该小肠类器官含有肠道上皮所有的细胞类型[1]。小肠类器官成熟后能以1 ∶5的比例进行传代培养，并且能在体外培养体系中连续传代培养超过1.5年，且在此过程中依然保持基因型及生理功能的稳定[5]。

1.2 肾脏类器官肾的功能单位由肾小球和肾小管组成，其功能依赖于其复杂的组织结构。肾在发育过程需要中胚层的输尿管芽与后肾间质之间的相互作用。Li et al[4]在适当的三维培养条件下，培养诱导多能干细胞来源的肾单位祖细胞，实现了肾单位祖细胞在体外培养体系中的长期扩增，扩增的肾单位祖细胞依然能保持基因组的稳定性、分子的均一性和发育成肾脏的潜能。培养的肾单位祖细胞可以形成肾脏类器官，植入新生小鼠及鸡胚体内的肾脏类器官可以与循环系统建立联系，形成异位肾样结构，将肾类器官移植到免疫缺陷小鼠网膜中，可产生尿液样滤液[4]。

1.3 生殖系统类器官在生殖系统中，利用非妊娠女性子宫内膜和蜕膜的样本，建立了遗传稳定的子宫内膜类器官，这些类器官可以对性激素的作用产生转录反应，并在催乳素和胎盘激素刺激下再现了妊娠期子宫内膜特征性的早孕信号[6]，这为了解早期妊娠期间子宫内膜分泌和子宫内膜-胎盘之间的相互作用奠定了基础。此外，男性生殖系统的类器官培养也取得了一些进展。Baert et al[7]发现人类初级睾丸细胞在新生小鼠睾丸类器官培养的条件下能够自组织成人睾丸类器官，尽管缺乏睾丸特异性的形貌，但这些微小组织中存在精原细胞及其重要的细胞生态位，同时这些细胞在长期培养过程中仍保留着特定的功能，这表明体外再造人睾丸微环境是可能的。

2 多能干细胞类器官构建

多能干细胞包括诱导多能干细胞和胚胎干细胞，此两种多能干细胞类型均可以自我更新并分化成所有的细胞类型 ，多能干细胞的这一特性为类器官的构建提供了理论支持。类器官的发展得益于人们对器官生长微环境的进一步认识，由于来源于多能干细胞的类器官是同质群体经过不同的阶段定向分化形成的，因此在培养过程中需要动态调整其阶段性的微环境。

在二维培养的条件中，多能干细胞在没有任何诱导信号的情况下，会成为神经元，分化的神经上皮细胞可以自组织成神经前体细胞花环结构。在此研究基础上，Eiraku et al[8]建立了神经外胚层类器官，这些类器官中的神经元表现出新生皮层脑组织的特性，并且类器官培养重现了早期皮质发生过程中的时空调控，通过这种方法产生的神经上皮细胞受到刺激后，表现出特定的脑区功能特性。研究[9]表明神经上皮细胞在基质胶中三维培养时，通过特定的细胞因子诱导，神经上皮细胞可自组织成由视网膜色素上皮和神经上皮组成的视杯。形态学、组织学和转录分析表明，这些大脑类器官包含了大脑相互依赖的各个部分[10]。单细胞RNA测序显示大脑类器官中具有祖细胞和分化表型的神经细胞及间充质细胞。同时在类器官和胎儿组织之间发现了显著的转录相似性，这为大脑类器官可作为人类皮质发育模型提供了依据[11]。

同样，多能干细胞来源的肝类器官的构建已有报道。用单细胞RNA测序法在二维培养的多能性的基础上重建了肝细胞谱系，之后在体外重建了肝脏、基质和内皮细胞之间的相互作用，解构了肝芽发育过程中的异质性，最终成功构建了肝芽类器官[12]。将肝芽类器官与胎儿和成人肝脏单细胞RNA序列数据进行对比，发现肝芽类器官与胎儿肝细胞之间存在显著的对应关系[13]，这为阐明肝脏发生发展提供了更加直接的证据。

3 应用

3.1 疾病模型肠类器官可以高度还原肠上皮细胞的体内生理环境和组织结构特征，并且可以排除肠道其他因素对研究的干扰，使得单独研究某种致病因素对肠道上皮的影响成为可能，因此在肠道感染性疾病研究中具有独到的优势。腹泻病现在仍然是世界上最大的健康问题之一，利用结肠、小肠类器官模拟肠道感染，既能研究宿主-病原体的相互作用，又能寻找治疗靶点。轮状病毒感染至今依然是威胁儿童健康的一大问题，每年导致超过45万5岁以下儿童死亡[13]。人源性肠类器官易受轮状病毒感染且对轮状病毒感染较为敏感，受感染的肠类器官能够产生感染性轮状病毒颗粒，使用干扰素α或利巴韦林治疗可抑制轮状病毒在人及小鼠肠类器官中的复制。重要的是，人源性肠类器官能有效支持患者来源的轮状病毒株的感染，并有可能用于抗病毒药物疗效的个性化评估[14]。二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)是嘧啶从头生物合成途径中的限速酶。研究表明DHODH抑制剂——布雷奎纳(BQR)和来氟米特(LFM)在常规人肠Caco2细胞系以及人肠类器官中强烈抑制轮状病毒复制。BQR和LFM通过靶向DHODH消耗嘧啶核苷酸池发挥其抗轮状病毒作用[15]。因此，靶向嘧啶的生物合成代表了开发针对轮状病毒的抗病毒策略的潜在方法。此外，小肠类器官模型同样已用来研究诺如病毒、星状病毒[16]等肠道感染性疾病。

3.2 筛选抗癌药物现已成功从结肠、肝脏、乳腺和胰腺的原发性肿瘤中培养出相应的肿瘤类器官。Vlachogiannis et al[17]从人源性的转移性胃肠道肿瘤组织中培养出肿瘤类器官，并在体外再现了这些患者对抗肿瘤药物的反应。研究证实人源性肿瘤类器官的表型和基因型与原发肿瘤有高度的相似性并且原发肿瘤细胞的特性可以在肿瘤类器官中保留，同时肿瘤类器官的分子分析与药物筛选结果相匹配。在预测患者对靶向药物或化疗的反应方面有100%的敏感性、93%的特异性、88%的阳性预测值和100%的阴性预测值。人源性肿瘤类器官还可以用于肿瘤的功能基因组学研究，在体外模拟肿瘤行为，并将分子病理学应用到早期临床试验的决策过程中。人源性肿瘤类器官可以在体外再现患者对抗肿瘤药物的反应，这些患者组织来源的肿瘤类器官作为临床前模型，在筛选个体对抗肿瘤药物的治疗反应方面有很强的特异性，肿瘤类器官的构建有望实现抗肿瘤药物使用的个性化。类器官模型同样在肿瘤耐药方面有着巨大的应用潜力，对于耐药机制的研究及药物筛选方面有着巨大的应用空间[2]。

3.3 药物开发药物开发是一个低效率、资源密集的过程，在大多数情况下新药开发很难获得成功。由于许多药物在Ⅲ期试验中失败或上市后才发现严重副作用，因此开发新药的平均成本往往超过10亿美元，这使得研究人员在选择最适合药物开发的临床前模型的过程变得尤为重要[18]。动物模型的可预测性有限导致了90%的药物在人体试验中失败[19]。动物模型与人体的差异同样可能使研究者错过本有治疗效果的药物，因为在动物身上的副作用不一定转化为人类。这些假阳性和假阴性的结果造成了巨大的财政负担，从而导致在决策过程中，更注重药物的潜在盈利能力而不是潜在的疾病治愈能力[20]。类器官在结构和功能上更接近人体，可以作为更准确的预测药物毒性的模型，现已证明肾脏类器官能够预测黑磷量子点[21]和顺铂[22]的肾毒性作用。此外，由于小肠上皮细胞含有大量的药物代谢酶和外源加工蛋白，在药物和外源物质的代谢、消化、营养吸收等过程中起着至关重要的作用，因此小肠类器官作为临床前模型现已用于药物开发[23]。神经元类器官作为神经疾病的研究模型在药物开发方面也已取得一些进展，例如与Timothy综合征突变相关的L型钙通道的药物调节剂，该药可恢复皮层神经元的迁移[24]。此外，神经元类器官在与内皮细胞共培养的过程中再现了血脑屏障的特征，从而为筛选靶向中枢神经系统药物提供了可能[25]。因此，类器官因其对人体器官结构和功能的高度还原，在测试药物作用及副作用方面有着巨大的应用空间。

3.4 基因和细胞疗法将结肠、肝脏、视网膜类器官分别移植到对应的受体器官中可观察到移植的类器官与受体发生功能整合。将体外培养的结肠类器官移植到小鼠结肠上皮损伤部位，发现结肠类器官会很快与小鼠结肠受损部位发生整合，覆盖上皮损伤部位，4周后供者来源的细胞形成单层上皮，形成功能和组织结构正常的上皮结构，并能维持上皮的更新[26]，这给肠道损伤修复提供了一个新的治疗策略。人的胰腺类器官移植到免疫缺陷小鼠后能形成胰岛素分泌细胞，利用胰腺类器官移植来降低血糖已在动物实验得以证实[27]。现已有一些支持细胞疗法可行性的证据，包括与自然组织的形态学相似性、建立与受体的联系、上皮通透性和对疾病及损伤的修复的能力[28]。利用CRISPR/Cas 9基因组编辑技术，通过同源重组来纠正囊性纤维化患者肠干细胞中的囊性纤维化跨膜传导调节因子的突变，恢复了囊性纤维化患者结肠器官中囊性纤维化跨膜传导调节因子蛋白的功能[29]。这些研究表明，在未来的细胞治疗方法中，类器官可能是细胞的来源。然而，还需要更多的研究来评估这种方法的有效性和安全性。

4 展望

类器官在组织工程及再生医学中拥有着广泛的前景，可以为器官移植提供新的思路。但仍存在许多挑战，如动物源性和化学成分未明的细胞外基质之间的可变性可能会影响高通量筛选。因此在将基础研究成果转化为临床应用时，此类外源性物质的作用使得转化过程也有存在问题的可能。为了解决这些问题，科学工作者正在开发能够根据需要改变其生物物理和生物化学性质的合成基质。此外，在体外培养体系培养类器官时会缺乏一些重要的生理过程，包括血管化和神经支配，这可能会阻碍类器官的研究。另外，在类器官体外培养体系中对生物物理外环境的控制、模拟组织-组织间的联系方面也存在挑战。为更精确地模拟体内器官的内环境及器官之间的相互作用，研究人员开发了类器官芯片，利用微流控技术更好地模拟器官生存的体内环境及实现多器官的联动[30]，但要真正实现对体内环境的精准模拟依旧任重道远。虽然类器官技术的应用依然存在诸多挑战，但其正以极其强劲的势头发展，随着体外培养技术的逐日完善及各种组织类器官的构建，这必将为疾病机制的探究、个体化治疗及药物开发提供强有力的实验模型。

综上所述，类器官与二维培养的细胞相比更接近原位组织的生理功能，相比于动物实验，类器官的操作更加简单直观，并且为那些在动物实验中无法准确建模的实验提供了一种替代方法。可以为器官发育、体内稳态和发病机制提供更直接的认知，并可能为疾病的诊断和治疗提供新的转化途径。患者组织来源的类器官可作为临床前模型，给临床研究开辟新的转化途径。类器官技术是一项有着广阔应用前景的新型技术，可能会给生物医学研究提供新的视角，完善类器官技术需要多学科的合作，以实现对人体环境的精准模拟及调控。