循环肿瘤DNA 在食管癌诊治中的应用

郭玉玉，余 宋，翟笑枫

（解放军海军军医大学第一附属医院中医肿瘤科，上海 200083）

食管癌（esophageal cancer）是世界上最常见和致命的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率分别排名第7 位和第6 位。该疾病病理类型主要分为鳞癌和腺癌，不同病理类型的食管癌流行病学分布明显不同，在欧洲以及北美地区，食管腺癌发病率偏高；在东亚、非洲东部以及南欧以食管鳞癌为主。我国食管癌以食管鳞癌为主，发病率居世界前5 名[1]。目前普遍认为影响食管癌患者预后的因素主要分为肿瘤的分期分级、复发转移以及对患者治疗后的反应。CT 等影像学方法在肿瘤患者管理中具有较多局限性，存在辐射暴露的风险、不能频繁检测、假阳性较高等问题，一般治疗较长的一段时间后才能进行有效评价，且只能评估可测量的病变等[2]。虽然CEA、CA199、NSE 等肿瘤标志物，能够无创、安全、频繁、实时进行检测，但其特异性和灵敏度欠佳，且其含量的变化无法反馈肿瘤反应或进展[3]。近年临床提出了液体活检的概念，最初主要指循环肿瘤细胞（CTCs）的分析，现在扩展到分析肿瘤在体液（主要是血液）中释放的肿瘤成分，包括无细胞循环核酸（DNA、mRNA、非编码RNA）等[4，5]，已广泛应用于多种肿瘤的诊断及预后。本文将从食管癌的早期诊断、临床分期及预后等方面对循环肿瘤DNA 的研究进展作简要概述。

1 ctDNA 概述

游离DNA（cell free DNA，cfDNA）是存在于体液中的细胞外DNA，来源于正常细胞和凋亡、坏死的肿瘤细胞，而循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是其中的一部分，既携带肿瘤细胞的基本遗传信息，又携带基因突变后的信息，包含点突变、重排、扩增甚至基因拷贝数变异[6]，尿液、脑脊液、胸液、腹水和唾液中均可检测到ctDNA 的存在，其来源于坏死的肿瘤细胞、凋亡的肿瘤细胞、肿瘤细胞分泌的外泌体[7]。在性质上，ctDNA 通常长度为160～180 bp，在血液中含量极低，约占所有cfDNA的0.01%～1%，其含量与肿瘤的类型、肿瘤负荷、疾病进展程度有关[8]。由于ctDNA 来源于肿瘤细胞，并且半衰期短，可以实时动态监测肿瘤的演变过程。

1948 年Mandel 和Metais 首次报道了外周血中存在cfDNA，目前cfDNA 已成为许多医学学科的热门研究领域[9]。通过测量ctDNA 等位基因突变片段可以获得定量信息，用于肿瘤诊断并反映肿瘤负荷情况。李红[10]研究表明，转移性乳腺癌患者外周血ctDNA 水平与肿瘤临床特征、患者疾病健康史无统计学关联，首程化疗前后血浆中ctDNA 水平对患者短期疗效转归具有良好的预测价值；对转移性乳腺癌患者ErbB 信号通路乳腺癌相关基因进行定性和定量研究对判断转移性乳腺癌患者预后提供重要依据。Chae YK 等[11]回顾性分析了136 例非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者血液中的ctDNA，结果发现较高浓度的ctDNA 与较短的PFS 和总生存期（overall survival，OS）有关。

2 ctDNA 在食管癌患者中的应用

2.1 用于食管癌的早期诊断与临床分期 肿瘤早期发现是减少肿瘤相关死亡的关键环节之一。早期食管癌没有特异性临床症状，确诊时多处于中晚期。但ctDNA 的异常在肿瘤发生的早期则可检测到。基因测序研究显示[12]，食管鳞癌的基因突变已在多个基因中得到验证，包括TP53、CDKN2A、FAT1、NOTCH1、PIK3CA、KMT2D 和NFE2L2。Talukdar FR等[13]对比分析了227 例食管鳞癌患者的正常组织、单纯增生的组织、上皮内瘤变，并对组织样本进行了全基因组、外显子组或靶向序列分析，结果得出食管上皮内瘤变和ESCC 组织具有相似的突变和拷贝数变化，频率相似。启动子高甲基化是一种肿瘤特异的表观遗传异常，发生速度高于突变，针对DNA 甲基化的ctDNA 检测技术也适用于早期癌症检测和筛查[14]。Li X 等[4]研究提示，肿瘤组织中epb41l3、gpx3 和col14a1 的甲基化频率高于正常周围组织，并且epb41l3、gpx3 和col14a1 基因的甲基化仅在食管鳞癌患者的血浆中发现。5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）是DNA 主动去甲基化的中间产物，是一种新的肿瘤表观遗传学标志物。研究表明[15]，5hmC 用于诊断食管癌的敏感度为93.75%，特异度为85.71%，可作为食管癌微创诊断的生物标志物。来自我国的一项研究采集了台州1156 份健康人群血浆样本进行癌症筛查，对样本血液中ctDNA 甲基化测序，并进行回顾性分析，共有575 名最初健康的研究参与者在4年内被诊断出患有结直肠癌、食道癌、肝癌、肺癌或胃癌，总体敏感性为95%，其中食管癌敏感度为91%，表明ctDNA 检测比传统方法可以更早的预测癌症的发生[16]。

此外，微卫星改变也可以从食管鳞癌患者的血清标本中发现。Eisenberger CF 等[17]检测了食管癌患者的肿瘤及血清中微卫星情况，并以健康个体作为对照，结果发现92.9%的食管鳞癌患者原发肿瘤中有1 个或多个微卫星DNA 改变，96.4%的患者血清中至少有1 个微卫星DNA 变化，而健康人对照者血清DNA 中均未发现微卫星改变，提示血清微卫星DNA 分析也是检测食管鳞癌的一个具有潜在临床应用价值的指标。有文献报道[18-20]，根据检测到的CTCs 和ctDNA 作为食管癌的临床分期依据，与经典的肿瘤TNM 分期之间存在着明显的相关性，因此建议将CTCs 和ctDNA 的检测作为临床肿瘤分期的重要组成部分，但是其可行性仍需要进一步评估。

2.2 用于食管癌的早期治疗 食管癌仅需接受单纯的手术或者放疗，而中晚期食管癌的标准治疗方案为同步放、化疗或者免疫治疗。研究表明[21]，食管腺癌患者ctDNA 数量和突变频率均随肿瘤分期增加而增加，并可在临床或影像学发现肿瘤进展前检测到ctDNA 水平变化。因此，对于临床分期为早期但伴有ctDNA 数量或频率增加的患者，给予更积极的治疗或可改善这部分患者的预后。晚期转移性食管癌患者通常会接受全身药物治疗。有研究显示[22]，上消化道肿瘤患者的不同转移病灶和原发肿瘤间的MET 基因扩增具有显著的异质性。单病灶活检的分子谱不足以指导靶向治疗药物的选择。ctDNA 来源于全身肿瘤，能克服肿瘤区域异质性问题，较全面地反映肿瘤基因全貌。Petty RD 等[23]设计了一项多中心前瞻性双盲实验，发现吉非替尼治疗的EGFR 扩增食管癌患者与安慰剂组相比，其总体生存率显著提高，但在EGFR 阴性食管癌患者中，吉非替尼组与安慰剂组相比总体生存率并没有显著差异。相关研究证实[24]，血浆ctDNA 中EGFR 的突变状态与相应的肿瘤组织相一致，提示可以使用血浆ctDNA 替代组织来评估EGFR 突变状态，筛选出适合接受吉非替尼治疗的患者。值得注意的是，食管鳞癌和食管腺癌在发病机制上显著不同，也具有明显不一样的分子特征。食管鳞癌表现出频繁的CCND1、NOTCH1、SOX2 和/或TP63 的基因组扩增，而ERBB2、VEGF、AKRAS、GATA4 和GATA6 基因改变则在食管腺癌中更为常见[25，26]，因此应慎重对待文献中关于食管癌药物治疗的相关结论。

2.3 用于食管癌的预后评估 早期发现对于复发后早期干预和延长患者生存至关重要。在进行根治性手术或者放化疗后，有相当一部分患者存在隐匿性微转移或微小残留病（minimal residual disease，MRD），而治疗后MRD 持续存在成为肿瘤远处转移复发的潜在来源[27]。ctDNA 具有监测隐匿性肿瘤和追踪肿瘤特异性突变的潜在能力，适合于MRD 的评估。目前，基于ctDNA 检测的液体活检技术已经广泛应用于血液系统疾病MRD 的监测。在食管癌等实体肿瘤中，ctDNA 浓度低，MRD 监测仍然具有挑战性。Luo H 等[28]通过对ESCC 组织、癌旁组织和正常组织以及手术前和手术后的血浆进行测序，分析了ctDNA 在ESCC 中的特异性和作用，结果证明利用ctDNA 检测ESCC 和监测治疗效果具有可行性。Azad T 等[8]通过对食管癌患者放化疗前后及健康对照组血液的DNA 进行肿瘤个性化深度测序（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq），发现放化疗后ctDNA 的检出率与肿瘤进展、远处转移和较短的生存期有关，提示ctDNA可反映食管癌相关的基因信息，并与其发生、发展密切相关，有望成为反映食管癌治疗效果及预后的生物标志物。在过去的几年里，肿瘤特异性生物标志物的检测技术取得了很大的进展，DDPCR、下一代测序（NGS）等实时、高度灵敏的液体活检技术的出现使得识别MRD 以及对罕见基因突变、基因甲基化序列的监测成为可能[29]。通过对接受根治性手术以及放化疗癌症患者，对比治疗前后ctDNA 水平的含量，能够有效地判断体内是否还存在着影像学或病理检查无法确认的微小残留灶，从而能够有效地指导后续抗复发治疗方案。研究显示[30]，术后ctDNA的浓度与患者生存率呈正相关。通过对肿瘤患者进行连续ctDNA 检测可以反映癌症进展和治疗耐药性的发生。

3 总结

液体活检已成为近年来的研究热点。ctDNA 是血液中来自肿瘤的游离DNA。由于ctDNA 来源于肿瘤细胞，并且半衰期短，可以实时动态监测肿瘤的演变过程。但ctDNA 在食管癌的临床应用仍存在诸多挑战，如ctDNA 检测的标准化、敏感性仍有欠缺，尤其对ctDNA 水平较低者，同一血液样本采用不同测序方法的检测结果也存在差异。总之，液态活检技术作为肿瘤诊断的新技术，除了可以获取肿瘤相关分子信息，还可以低创动态地对疾病进行早期诊断，帮助临床医师及时调整治疗方案，并进一步研究疾病的发生发展机制，且有助于靶向药物的研发。