马兜铃酸减毒与分离方法研究进展*

2022-11-27余寒优张迎庆

中国药业 2022年7期

程玉，余寒优，索芳，任青，张迎庆

（湖北工业大学生物工程与食品学院制药工程系，湖北武汉 430068）

马兜铃科植物在《神农本草经》《雷公炮炙论》《肘后备急方》《妇人大全良方》等文献中均有记载。其品种有600 多种，分布广泛，在世界各地有数百个品种被用于治疗疾病，如马兜铃属在印度用于解蛇毒、缓解关节痛和发热，在巴西用于止泻、镇痛、消炎、抗癌等。我国含马兜铃酸的药材主要包括马兜铃科马兜铃属AristolochiaL. 和细辛属AsarumL.，如马兜铃、天仙藤、朱砂莲、细辛、关木通、青木香、广防己、寻骨风等［1］。马兜铃科植物中的马兜铃酸具有强烈的致癌性和肾毒性［2-3］，是3，4-次甲二氧基-10-硝基-1-菲酸衍生物，有多种基本组成结构。目前，有明确毒性作用的成分有马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ［4］，其余部分的肾毒性及致癌性差异尚未明确。马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ在体内硝基还原酶的作用下，一部分被还原为马兜铃内酰胺，进入肾小管上皮细胞，经长时间积累而导致毒性；另一部分在还原过程中进一步与DNA 作用，形成加合物，直接损伤DNA，最终导致基因突变，产生毒性。流行病学证据表明，马兜铃酸能与DNA 形成亲电加合物，并出现具有突变标识特征的碱基对“A∶T →T∶A 颠换突变”，致人体患癌［5-6］。据国际致癌物评价标准，确认马兜铃酸为一级致癌物［7］。故各国均限制或禁止销售和使用含马兜铃酸的中药材和中成药，我国也取消了关木通、青木香、广防己的药材标准，并对含马兜铃、寻骨风、天仙藤、朱砂莲的中药制剂按处方药的标准进行严格管理，并在药品标签和药品说明书中增加可引起肾脏损害的安全警示信息。2020 年版《中国药典（一部）》剔除了天仙藤和马兜铃，仅收录细辛，规定药用部位为根和根茎，并对限度进行了严格规定。同时，提高了相关中成药制剂的药品标准，拟增加马兜铃酸限量检查，近年来关于马兜铃酸减毒的研究日益增多［8-9］。为此，在马兜铃酸传统减毒方法的基础上，综述了现代分离纯化技术在马兜铃酸的减毒、固相萃取富集分析，以及在不同马兜铃酸组分标准品制备中的应用与研究进展，为含马兜铃酸中药材的合理使用和相关中成药的检测提供参考。现报道如下。

1 传统减毒方法

1.1 炮制减毒

炒焦：严建业等［10］研究了细辛的不同炮制方法，马兜铃酸减毒效果按炒焦> 碱醋制> 盐制> 碱制> 醋制>米泔水制>甘草制>酒制>蜜制>姜制顺序依次降低。其中，炒焦工艺对细辛中马兜铃酸Ⅰ的去除率最高，超过60%（质量分数）。

醋炙：李天凤等［11］对关木通进行姜炙、醋炙、蜜炙、甘草炙、碱制、炒炙、酒炙，以及碱蜜合制、碱酒合制、碱姜合制，并采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定各炮制品马兜铃酸的含量，计算其脱除率。结果关木通醋炙品中马兜铃酸含量较低，且其醋炙品水浸出物与醇浸出物的含量均较高。与其他方法相比，醋炙法更稳定。

蜜炙：章莹等［12］分析不同产地马兜铃蜜炙后的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，发现蜜炙后马兜铃酸Ⅰ含量降低了36%，且最适蜜炙条件为加蜜量30%（质量分数），蜜 - 水比例为1∶3（V/V），温度为200 ℃，加热25 min。

润洗、阴干：姜思奇等［13］研究了北细辛饮片的炮制工艺与药材质量间的相关性。结果显示，北细辛药材润洗5 min、24.6 ℃阴干24 h，或润洗5 min、25.0～35.0 ℃烘干8 h，均可符合北细辛饮片要求。综合考虑后，将北细辛药材润洗48 h，24.6 ℃阴干48 h，马兜铃酸Ⅰ的含量由9.87 μg/g 降至7.99 μg/g。故可将其作为北细辛饮片的减毒工艺。

发酵：发酵法通过微生物降解中药中有毒物质，与普通炮制方法相比优势显著，其工艺条件温和，无污染。曹艺等［14］采用液体发酵技术，以关木通、青木香、马兜铃、寻骨风药材粉末为原料，在黑曲霉、米曲霉等10个菌种的发酵降解下进行生物转化脱毒。采用超高效液相色谱（UPLC）法测定发酵前后药材中马兜铃酸Ⅰ的含量，结果表明，枯草芽孢杆菌可降低药材中马兜铃酸Ⅰ的含量。LIU 等［15］采用高效液相色谱 - 电喷雾飞行时间质谱法测定马兜铃植物根部与6 种不同药用真菌经固态发酵所得发酵产物中马兜铃酸的含量，拟订色谱条件［色谱柱为C18柱，检测器为二极管阵列检测器，温度为30 ℃，流动相为乙腈（A）-0.2%乙酸（B）］进样测定。结果发现，0～20 min 内出现了新的色谱峰，采用柱后分流法进行电喷雾离子化质谱（ESI- MS）负离子模型检测，推断出7个马兜铃酸成分。在发酵过程中，上述7 种化合物含量均减少，说明发酵可有效减毒。此外，优化后的HPLC - MS 法有助于马兜铃酸的含量测定。向薇［16］从马兜铃根际土壤中获得33 株纯培养菌株，经验证，其中11株均对马兜铃酸Ⅰ有降解作用，在非优化条件下48 h 内可最多降解85.36%（质量分数）的马兜铃酸Ⅰ。将获得的降解菌株用于马兜铃酸Ⅰ含量较高的青木香进行发酵炮制，再结合筛选得到的分子标志物进行肾毒性评价，效果较好。

1.2 配伍减毒

单味药：配伍的单味中药主要有补益类中药黄芪、冬虫夏草、当归、甘草等，活血类中药丹皮、丹参等，清热类中药生地黄、竹叶、黄连等，泻下类中药大黄等［17］。马艳苗等［18］通过RP-HPLC 法考察了关木通配伍苦寒药黄连后马兜铃酸Ⅰ的含量变化趋势。结果显示，不同比例配伍组中马兜铃酸Ⅰ的含量不同，特别是关木通与黄连配伍比例为1∶1.5（m/m）时，马兜铃酸Ⅰ含量下降了72%（质量分数）。提示“寒寒相配”的中药配伍形式有助于降低关木通中马兜铃酸Ⅰ的含量，中药配伍减毒理论有一定科学依据。邵珠莹等［19］采用超高效液相色谱- 三重四极杆质谱串联（UPLC - TQD - MS）法探讨了关木通配伍干姜的减毒存效机制，结果显示，关木通-干姜（1∶2，m/m）配伍组马兜铃酸Ⅰ对大鼠急性肾功能的损伤程度显著低于生品组，且不影响对大鼠的利尿作用。

复方：汪潇晗等［20］报道了复方（如龙胆泻肝汤、复方导赤散）与拆方配伍对关木通减毒作用的影响，发现复方配伍组中马兜铃酸溶出量较关木通单煎组显著下降。曹小帅等［21］采用中成药制剂配伍来减毒，如脑灵片由黄精、红参、鹿茸等11味中药材组方，有补气血、养心肾功效，与关木通共煎后，测得的马兜铃酸Ⅰ含量明显降低。

在传统中医基础理论指导下，中药配伍可实现减毒增效。按准确配伍用量，采用现代炮制技术能减少其大部分毒性成分，但尚需制订详细的量化指标及使用规范，以指导临床使用。

2 分离纯化方法

2.1 超临界流体萃取法

超临界流体萃取法是利用超临界流体提取、分离有效成分的新技术。超临界流体的溶解性、渗透性及扩散性能均高，黏度低，通过改变压力或温度来调节其溶解能力，实现对不同成分高选择性地提取分离，多用于天然活性物质的提取分离［22-24］。LIANG 等［25］评价了超临界流体萃取法去除马兜铃和关木通中马兜铃酸的可行性，结果表明，萃取方式和夹带剂的摩尔分数是影响马兜铃酸萃取的主要因素。去除马兜铃酸的最适动态条件为容器压力194 bar，温度50 ℃，夹带剂浓度0.2 摩尔分数，萃取4 h。结果显示，马兜铃中马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ的去除率分别为65.2%和59.1%（质量分数），关木通中的去除率分别为81.3%和81.2%（质量分数）。

2.2 分子印迹法

2.2.1 减毒

分子印迹是一种为获得在空间结构和结合位点上与特定目标分子相匹配的聚合物的技术，制备的分子印迹聚合物（MIP）对目标分子具有特异性和选择性，广泛用于中药研究［26-27］。肖榕［28］采用可逆加成断裂链转移聚合（RAFT）法制备了马兜铃酸分子印迹微球，并对其吸附性能进行研究。以马兜铃酸Ⅰ为模板分子，丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）为交联剂，二硫代苯甲酸（4-氰基戊酸）酯为链转移剂，偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂，二甲基甲酰胺-水溶液（8∶2，m/m）为致孔剂，采用RAFT 技术制备MIP，其收率为63.42%。所得MIP 对模板马兜铃酸Ⅰ具有良好的特异性和选择性吸附能力，可至少重复使用6 次。取25.0 mg MIP 可吸附5.0 mL 关木通乙醇提取物（马兜铃酸Ⅰ质量浓度为0.001 8 mg/mL），结果马兜铃酸Ⅰ含量降至液相的检测限（6.47 ng/mL）以下，平均回收率为41.70%。结果表明MIP 可用于去除天然产物中马兜铃酸Ⅰ。

2.2.2 固相萃取富集

固相萃取是常用的样品分析检测前处理技术，通过固体吸附剂吸附液体样品中的目标物质，与其他干扰物分离，利用洗脱液或加热解吸附洗脱，达到目标化合物分离和富集的目的［29］。目前，溶剂萃取-柱色谱分离法为常用的马兜铃酸富集检测方法，需多次抽取、萃取、脱色等，以及柱色谱分离，操作烦琐，耗时，成本高，富集效率不高，提取量受限。一般固相萃取材料采用C18柱和C8柱，对强保留杂质无法有效去除。MIPs合成的固相萃取材料因识别性能好、富集效率高而受到青睐。分子印迹技术用于马兜铃酸的分析检测预处理时，可从中药材浸取液中经固相萃取富集分离马兜铃酸，检测灵敏度高。

傅强等［30］报道了从中成药龙胆泻肝丸中富集与检测微量马兜铃酸Ⅰ的方法，首先进行硅胶活化，对硅胶表面进行氨基化改性，再在硅胶表面合成MIP；将所得MIP 装柱，以甲醇活化，制备得到分子印迹-固相萃取柱，可用于检测富集中成药龙胆泻肝丸中的马兜铃酸Ⅰ。该方法操作简单，且采用伪模板分子氧氟沙星代替马兜铃酸Ⅰ，富集过程安全、环保，结合容量高，传质速率快，富集效率高。GE 等［31］也报道，以伪模板分子氧氟沙星代替马兜铃酸Ⅰ制备的MIP作为固相萃取吸附剂，从中药材中分离富集马兜铃酸。结果显示，马兜铃酸Ⅰ富集达16 倍，其质量浓度在0.1～200.0 μg/mL 范围内线性关系良好（R2=0.998 7），回收率为64.94%～77.73%，精密度试验的RSD≤0.8%。

GE 等［32］合成了一种混合磁性介孔碳分子印迹聚合物（MMC@MIPs），用于从大鼠尿液样本中选择性识别马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ。以氯化胆碱/乙醇基深共晶溶剂和吲哚美辛分别作为洗脱剂和假模板分子，研究了制备材料的形貌、结构和表面基团，并筛选MMC@MIPs - MSPE 工艺的最佳条件。结果表明，该方法回收率较好（86.7%～94.3%），标准偏差较小（<4.85%），在0.5～30 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好（R2为0.991 0～0.996 0）。

LI 等［33］报道了 MIP 功能化的磁性碳纳米管（MCNTs）对马兜铃酸Ⅰ的去除效果。通过一种简便、环保的溶胶-凝胶工艺获得MCNTs@AAI-MIPs，先用溶剂热法合成MCNTs，在乙醇和水的作用下，模板分子与功能单体苯三甲氧基硅烷自组装，以正硅酸四乙酯为交联剂，在MCNTs 上涂覆马兜铃酸Ⅰ- MIPs 膜，得到MCNTs@马兜铃酸Ⅰ-MIPs。结果表明，印迹纳米复合材料分离速度快（10 s），吸附容量高（18.54 μg/mg），动态平衡时间短（15 min），选择性好，模板分子印迹因子为3.17，可从复杂的中药样品中有效、特异地提取马兜铃酸Ⅰ。

陆雅婷等［34］采用表面分子印迹技术制备了马兜铃酸Ⅰ磁性MIPs，载体为经过硅壳改性后的Fe3O4，功能单体为甲基丙烯酸，交联剂为EGDMA，引发剂为AIBN，溶剂体系为乙腈-甲醇（3∶1，V/V），且模板分子、功能单体、交联剂质量比为1∶4∶20，形成表面印迹层，得到对马兜铃酸Ⅰ有特异性吸附作用的MIPs，印迹效率可达3.11，可用于实际样品中马兜铃酸Ⅰ的富集和分析。

2.3 吸附法

2.3.1 减毒

孙博航等［35］报道了采用离子交换法从中药材北细辛中获得无毒提取物的制备工艺。北细辛全草经热水煎煮提取，取滤液，冷却后调节pH 值。采用阳离子、阴离子交换法，可去除北细辛药材中具有挥发性的黄樟醚，以及非挥发性的马兜铃酸、乌头碱、去甲乌头碱等有毒成分，能较好地保留有效成分，兼顾性强，工艺简单，能源消耗低，节约资源，生产过程清洁无污染。

2.3.2 固相萃取富集

张晓哲等［36］大孔树脂法富集马兜铃酸预处理，采用自制价廉的大孔吸附树脂萃取柱，大孔吸附树脂填料为HPD-100/Diaion/AB-8，填料装填体积保持为上样溶液体积的2～5 倍，以不高于40%甲醇或乙醇溶液除去杂质，以70%～100%甲醇或乙醇溶液洗脱富集马兜铃酸类化合物，回收率高，稳定性好，价格低廉，更适合微量马兜铃酸的富集和高灵敏测定。

FANG 等［37］报道了一种双离子液体固定化硅胶多相萃取马兜铃酸的方法，可从实际样品中分离马兜铃酸。结果显示，在60 ℃的流动相甲醇 - 水（60∶40，V/V）中，与其他吸附剂相比，IM -BIM@Sil 提取的马兜铃酸量最多（16.69 mg/ g）。将该吸附剂用于马兜铃酸的多相萃取，经过提取8 次，多次洗涤和洗脱，从9 个真实样品中分离到（2.4～70.9）× 10-3mg/ g 马兜铃酸，回收率为70.0%～110.6%，RSD为3.5%～9.1%，表明方法准确性高。

CHEN 等［38］将双离子液体固定于一种金属-有机骨架ZIF-67制备成吸附剂，用于黄藤中马兜铃酸Ⅰ固相萃取。吸附模型分析结果显示，在25 ℃下120 min内，固定化吸附剂的吸附量最高（50.9 mg/g）。固相萃取过程中每1 g 药材可除去0.02 mg 马兜铃酸Ⅰ，回收率为96.2%～100.0%，RSD为3.5%～4.0%。

SHU 等［39］将螺旋碳纤维与壳聚糖杂化材料作为固相萃取吸附剂，用于马兜铃酸分析检测的富集预处理。利用螺旋碳纤维的超强容量，并在表面修饰壳聚糖，壳聚糖带有大量氨基和乙酰氨基，在稀酸溶液中易质子化并以阳离子形式存在，能与有机酸通过静电相互作用形成复合物，并通过控制pH 实现选择性吸附和脱附。壳聚糖改性螺旋碳纤维对马兜铃酸Ⅰ结合能力优良（77.72 mg/ g），选择性高。采用固相萃取结合HPLC法对药用植物中马兜铃酸Ⅰ进行了富集和检测。马兜铃酸Ⅰ的质量浓度在0.5～150 mg/L 范围内线性关系良好，回收率为73.61%～77.73%，RSD<5%。

SHU 等［40］报道了腺嘌呤修饰的磁性多壁碳纳米管用于基于多种相互作用的马兜铃酸的选择性提取。该吸附剂对马兜铃酸的吸附量为24.5 μg/mg，建立了富集和检测中药中马兜铃酸的磁性固相萃取-高效液相色谱法。马兜铃酸Ⅰ的回收率为92.7%～97.5%，马兜铃酸Ⅱ的回收率为92.6%～99.4%，RSD<4%。

2.4 液液色谱法

为了分离毫克级的不同类型马兜铃酸，采用无固相支持的液液色谱技术，如逆流色谱（CCC）法和离心分配色谱（CPC）法均可适用于分离极性次级代谢产物，无论是在洗脱或pH 区带精制和离子交换置换模式下均可进行。强离子交换模式离心分配色谱（SIX -CPC）法适用于分离离子化或可离子化的代谢产物，如羟基肉桂酸、迷迭香酸、硫代葡萄糖苷、花青素、皂苷或多肽。SIX-CPC法中交换剂为离子型，在任何pH下均保持正电荷（阳离子交换剂）或负电荷（阴离子交换剂），阴离子交换剂主要是苯扎氯铵、三辛基甲基氯化铵（Aliquat 336®）等季铵盐，离子型分析物形成稳定的离子对直接捕获到固定相中。无置换剂的流动相不能洗脱所提取的分析物，加入置换剂时分析物出现在流动相中。所有分析物沿柱以相同的速率移动，而移动速率取决于置换剂的浓度。SIX-CPC 法会通过不同分析物与交换剂间形成离子对的差异实现高分辨纯化。ABDELGADIR等［41］采用基于强离子交换置换的SIX -CPC 法提取纯化了的小苞马兜铃（Aristolochia bracteolataLam.）的马兜铃酸，一步制备便可分离得到马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲa。方法为采用双相溶剂系统甲基叔丁基醚-丙酮 -甲醇 - 水（3∶1∶1∶3，V/V/V/V），三辛基甲基氯化铵（Aliquat 336®）为有机固定相的阴离子交换剂，碘化钠为水流动相的置换剂。从5 g 小苞马兜铃粗提物中分别得到45.5，77.2，35.1 mg马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲa，纯度均大于95%（质量分数）。

段文娟等［42］报道了一种基于pH 区带逆流色谱技术的快速分离纯化马兜铃酸类化合物的方法，能对关木通药材中的马兜铃酸类化合物实现有效分离纯化。该方法在普通制备型高速逆流色谱分离纯化有机酸类成分的应用基础上发展而来，并根据化合物解离常数（pKa）大小依次洗脱，尤其适合有机酸类物质的分离。pH区带逆流色谱法进样量分离效率均高，分离效果好，杂质易收集，可实现pH 监控，待分离组分被高度浓缩。由于马兜铃酸类化合物苯环上连接的基团不同，化合物的pKa 也存在一定差异，故可采用pH 区带逆流色谱法进行富集与分离。具体方法：将关木通粉碎后使用乙醇加热回流提取，减压浓缩得浸膏，加水混旋，使用石油醚、乙酸乙酯萃取，减压蒸干得马兜铃酸总提取物；采用pH 区带逆流色谱进行分离与富集，以石油醚-乙酸乙酯 - 正丁醇 - 水体系（5∶5∶1∶6，V/V/V/V）为溶剂分层后在上相固定相和下相流动相中分别加入一定量的三氟乙酸和三乙胺，泵入高速逆流色谱仪后进行分离纯化，可在10 h内一次性制备4个纯度大于95%的马兜铃酸组分（马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲa、马兜铃酸Ⅳa），制备成本低于现有技术，操作简便，效率高，且环保，明显优于现有硅胶柱色谱法或HPLC法。