基于元素及稳定同位素分析的大黄鱼产地区分技术

梅光明，杨盈悦，张玉汝，赵月涵，张小军*，黄丽英，郑斌

（1.浙江省海洋水产研究所，浙江 舟山 316021；2.浙江省海水增养殖重点实验室，浙江 舟山 316021；3.浙江海洋大学 食品与医药学院，浙江舟山 316022；4.浙江舟山环境工程设计有限公司，浙江舟山 316000）

大黄鱼（Larimichthys crocea）是石首科、黄鱼属鱼类，又名黄花鱼、黄瓜鱼［1］，因肉质鲜嫩细腻，且富含氨基酸、脂肪酸和矿物元素等营养成分［2］，深受消费者喜爱。目前学界将分布在我国近岸沿海的大黄鱼分为岱衢族、闽—粤东族和硇洲族3个地理种群，其中，闽—粤东族主要分布于东海南部和南海北部（福建嵛山岛以南到珠江口），硇洲族主要分布于珠江口以西至琼州海峡以东，岱衢族主要分布于黄海南部和东海北部沿岸浅海［3-4］。浙江沿海的岱衢洋、大目洋、猫头洋及江外渔场、舟外渔场等都是岱衢族大黄鱼的主要生栖场所［5-9］。20 世纪70 年代起，由于过度捕捞及受环境污染影响，野生大黄鱼骤降为稀缺资源，目前依靠人工养殖技术，大黄鱼已成为我国产量最大的海水养殖鱼类［10］。2020 年全国大黄鱼养殖产量达2.54×108kg［11］，主要分布在福建、浙江和广东等地。从以近岸传统网箱养殖为主向深水网箱、牧场化围栏和深远海养殖等发展。普遍认为自然海域野生大黄鱼的品质优于养殖大黄鱼，不同地域环境、不同养殖模式和不同品系的大黄鱼在营养及口感上也存在明显差异［12-16］。不同产地大黄鱼市场售价差距较大，如野生大黄鱼每斤售价高达千元及以上，养殖大黄鱼每斤售价为一二十元至上百元不等。在巨大经济利益驱动下，以养殖大黄鱼充当野生大黄鱼、以普通网箱养殖大黄鱼冒充深海养殖大黄鱼，“挂羊头卖狗肉”类造假销售事件时有发生。与此同时，近年来国内关注的水产品“三鱼两药”问题，从大黄鱼中检出禁用药物氧氟沙星等也时有报道，因此，有必要建立大黄鱼产地的准确溯源技术，为维护消费者合法权利和保障水产品质量安全提供有效手段。

利用农产品地理环境、生产方式、气候条件及种间差异等因素引起的矿物元素质量分数差异或13C、15N和18O 等同位素分馏效应成为国内外农产品溯源中常用的一种手段，目前该项技术已应用于谷物、畜禽肉和果蔬［17-19］等农产品的产地溯源，而在水产品产地溯源上的应用研究较少。文献［20-27］报道了矿物元素或稳定同位素分析在蛤仔、鳗鱼、鲭鱼、鲈鱼、鳕鱼、中华绒螯蟹、鲍鱼、扇贝和带鱼等水产品产地溯源中的应用，尚未见该项技术应用于大黄鱼产地溯源的报道，当前在大黄鱼产地区分上仍缺乏有效的技术手段。本研究尝试采用具有高通量和高分辨率分析优势的电感耦合等离子体质谱仪及元素分析—同位素质谱仪，对浙江市场上常见的4 种来自不同产地的大黄鱼样品（福建宁德养殖、浙江温州养殖、浙江舟山养殖和舟山渔场自然海域捕捞）进行19 种矿物元素和碳、氮元素及其稳定同位素质量分数差异分析，结合主成分分析、聚类分析和Fisher 判别等统计学方法，对4 种不同产地大黄鱼进行产地判别研究，为大黄鱼产地鉴别提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Vario EL III-Isoprime 元素分析—同位素质谱仪（配高温燃烧炉、吸附—解吸装置和高灵敏度热导检测器，德国Elementar 公司）；Agilent 7900 电感耦合等离子体质谱（美国安捷伦公司）；ETHOSUP 型微波消解仪（意大利Milestone 公司）；VB24 plus 型微波消解赶酸架（北京莱伯泰科仪器股份有限公司）；T18 实验室高速分散机（德国IKA 公司）；SCIENT—10N 真空冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；M5X 微量电子天平（瑞士梅特勒—托利多公司）；905—ULTS 超低温冰箱（美国Thermo 公司）。

19 种单元素标准溶液Mg（GSB 04—1735—2004）、Al（GSB 04—1713—2004）、Na（GSB 04—1738—2004）、Sn（GSB 04—1753—2004）、Ca（GSB 04—1720—2004）、Fe（GSB 04—1726—2004）、Se（GSB 04—1751—2004）、Sr（GSB 04—1754—2004）、K（GSB 04—1733—2004）、Zn（GSB 04—1761—2004）、Ba（GSB 04—1717—2004）、Mn（GSB 04—1736—2004）、Cu（GSB 04—1725—2004）、Ni（GSB 04—1740—2004）、V（GSB 04—1759—2004）、Ti（GSB 04—1757—2004）、Co（GSB 04—1722—2004）、Mo（GSB 04—1737—2004）、Cr（GSB 04—1723—2004），浓度均为1 000 μg·mL−1，国家有色金属及电子材料分析测试中心；酪蛋白和USGS40 标准品，英国Elmental Microanalysis公司；GBW10023 扇贝粉，67%～70% HNO3，MOS级，德国CNW 公司；30% H2O2，优级纯，国药集团化学试剂有限公司；WO3，高纯线状铜及银棉，上海艾利蒙塔贸易有限公司；高纯He、N2和O2，浓度≥99.999%，上海弥正气体有限公司；高纯CO2，浓度≥99.995%，普莱克斯（上海）工业气体有限公司。

1.2 样品来源

2020 年9 月至2021 年6 月共收集39 份大黄鱼样品。其中福建宁德养殖大黄鱼样本10份，近岸普通网箱养殖；浙江温州养殖大黄鱼样本10 份（产地为温州苍南、平阳和南麂岛），含普通网箱养殖和深水网箱养殖；浙江舟山养殖大黄鱼9 份（产地为舟山嵊泗和东极），含深水网箱和围网养殖；舟山渔场自然海域捕捞大黄鱼10份，于舟山市国际水产城码头某停靠渔船购入，经渔民捕捞日志确认在北纬30°28'、东经122°42'的舟山渔场海域捕获，并经浙江省海洋水产研究所渔业资源专家鉴定，符合野生岱衢族大黄鱼生物学特征。大黄鱼单体体重400～550 g，体长22～30 cm，将新鲜样品装入带冰泡沫箱，6 h 内运回实验室处理。取背部肌肉，匀浆、冷冻干燥，在玛瑙研钵内碾碎后过16 目筛，样品于−65 ℃冻藏备用。

1.3 方法

1.3.1 矿物元素

依据GB 5009.268—2016［28］中ICP-MS 法测定19 种矿物元素质量分数。取冻干后的大黄鱼样品粉末0.1 g（精确到0.000 1 g）于聚四氟乙烯消解罐中，加入6 mL HNO3和2 mL H2O2，静置2 h 后进行微波消解。微波消解程序：（1）由室温升至140 ℃，需时5 min；（2）再升至200 ℃，需时10 min，恒温20 min；（3）15 min 内由200 ℃降至室温。微波消解后于160 ℃下赶酸20 min，冷却后用纯水定容至50 mL，待ICP-MS 测定。测定过程中在线加入1 μg·mL−1的Sc、Ge、Rh 和In 混合内标液，同时测定质控样品GBW10023 扇贝粉，对结果进行质量控制（当质控样品各元素测定结果在标准参考值范围内时，代表该批实验数据的准确性较好）。

1.3.2 C、N 元素

用Vario EL Ⅲ元素分析仪测定C、N 元素质量分数。取2 mg 冻干后的大黄鱼样品，用锡囊紧密包裹成小球，放入仪器进样盘，样品经过高温燃烧氧化还原后，各气体通过吸附/解析柱分离，热导检测器检测。仪器条件：氧化管填充WO3，温度1 150 ℃；还原管填充线状铜及银棉，温度810 ℃；高纯He 作为载气及参比气。

1.3.3 碳、氮稳定同位素比率δ13C、δ15N

将Vario EL Ⅲ元素分析仪氧化还原产生的N2、CO2经接口进入Isoprime 同位素质谱仪，测定碳、氮稳定同位素比率δ13C、δ15N。同位素质谱仪条件：应用连续流进样系统，CO2、N2作为参比气，USGS40（L-glutamic Acid）作为标准品（δ13CVPDB=−26.39±0.04‰，δ15NAIR=−4.52±0.06‰），对参比气CO2、N2进行校准。碳、氮稳定同位素比率计算式为：

1.4 数据处理

用3 次重复测定的平均值加减标准偏差表示测定数据。用IMB SPSS23 进行数据统计、方差分析（ANOVA）、事后多重比较（LSD 和Tamhane′sT2检验）和Fisher 判别分析，用R（4.1.2）中FactoryMine R 包和NbClust 包进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚类分析（cluster analysis，CA），用Origin 8.5 绘图。

2 结果与分析

2.1 矿物元素的质量分数

4 种产地大黄鱼样本中19 种矿物元素的测定结果见表1。单因素ANOVA 及事后多重比较表明，Mg质量分数，各产地样本间除福建宁德养殖大黄鱼与浙江舟山养殖大黄鱼不存在显著性差异（p>0.05）外，均存在显著差异（p<0.05），Mg 质量分数最高的为舟山渔场海域捕捞大黄鱼，均值高达1.43 g·kg−1；Al 质量分数，除浙江温州养殖大黄鱼与浙江舟山养殖大黄鱼之间无显著性差异（p>0.05）外，其余各产地间均存在显著性差异（p<0.05），Al 质量分数最高的为福建宁德养殖大黄鱼（17.49 mg·kg−1），最低的为浙江舟山养殖大黄鱼（1.98 mg·kg−1）；K 质量分数，舟山渔场海域捕捞大黄鱼显著高于浙江舟山养殖大黄鱼（p<0.05），二者又均明显高于福建宁德养殖大黄鱼与浙江温州养殖大黄鱼（p<0.05）；Ti质量分数，福建宁德养殖与浙江舟山渔场海域捕捞大黄鱼均明显高于浙江温州养殖和浙江舟山养殖大黄鱼（p<0.05）；Cr 质量分数，福建宁德养殖大黄鱼显著低于浙江温州养殖大黄鱼（p<0.05）；Cu 质量分数，浙江温州养殖大黄鱼和浙江舟山养殖大黄鱼均显著高于福建宁德养殖大黄鱼和舟山渔场海域捕捞大黄鱼（p<0.05）；Zn 质量分数，福建宁德养殖大黄鱼显著低于其他3个产地，其中舟山渔场海域捕捞大黄鱼最高（均值为17.4 mg·kg−1），显著高于浙江温州养殖大黄鱼（p<0.05），但与浙江舟山养殖大黄鱼无显著差异（p>0.05）；Se 及Ba 质量分数，舟山渔场海域捕捞大黄鱼最高，均显著性高于其他3个产地的（p<0.05）；Sn 质量分数，浙江温州养殖大黄鱼显著高于其他3个产地的（p<0.05）。此外，舟山渔场海域捕捞大黄鱼的Na 和Mo 平均质量分数最高；浙江温州养殖大黄鱼的Fe、V 和Ni 平均质量分数最高；浙江舟山养殖大黄鱼的Ca、Mn、Co 和Sr 平均质量分数最高。但上述元素质量分数范围在4个产地间无显著差异（p>0.05）。

表1 不同产地大黄鱼肌肉中19 种矿物元素的质量分数Table 1 Quality scores of 19th mineral elements in muscles of L.crocea from different producing areas

2.2 δ13C、δ15N 值和C、N 质量分数

表2 为不同产地大黄鱼样本中的δ13C、δ15N 值和C、N 质量分数。δ13C 值为−16.78‰～−24.24‰，平均值：舟山渔场海域捕捞大黄鱼（−17.62‰）>浙江温州养殖大黄鱼（−20.43‰）>福建宁德养殖大黄鱼（−20.64‰）>浙江舟山养殖大黄鱼（−21.34‰）；δ15N 值为7.66‰～12.79‰，平均值：舟山渔场海域捕捞大黄鱼（11.79‰）>福建宁德养殖大黄鱼（10.98‰）>浙江温州养殖大黄鱼（10.78‰）>浙江舟山养殖大黄鱼（8.83‰）；C 质量分数为44.03%～60.42%，平均值：福建宁德养殖大黄鱼（53.45%）>浙江温州养殖大黄鱼（52.19%）>浙江舟山养殖大黄鱼（50.96%）>舟山渔场海域捕捞大黄鱼（47.69%）；N 质量分数为7.99%～13.69%，平均值：舟山渔场海域捕捞大黄鱼（12.57%）>浙江舟山养殖大黄鱼（11.03%）>福建宁德养殖大黄鱼（10.37%）>浙江温州养殖大黄鱼（10.07%）。根据单因素ANOVA 及事后多重比较，福建宁德养殖大黄鱼的δ13C 值和N 质量分数均显著低于舟山渔场海域捕捞大黄鱼（p<0.05），δ15N 值显著高于浙江舟山养殖大黄鱼（p<0.05），C 质量分数显著高于舟山渔场海域捕捞大黄鱼（p<0.05）；浙江温州养殖大黄鱼的δ15N 值显著高于舟山养殖大黄鱼（p<0.05），其余指标与浙江舟山养殖大黄鱼无显著差异（p>0.05）；舟山渔场海域捕捞大黄鱼的δ13C 值和N 质量分数均显著高于其他3个产地大黄鱼（p<0.05），δ15N 值显著高于浙江舟山养殖大黄鱼（p<0.05），而C 质量分数显著低于其他3个产地大黄鱼（p<0.05）。刘小琳等［29］得到在宁波舟山一带海域捕捞的大黄鱼其δ13C和δ15N 值分别为（−17.02±1.38）‰ 和（11.29±0.25）‰，石焱［30］调查得到夏季福建闽江口大黄鱼的δ13C 和δ15N 值分别为（−19.71±0.57）‰和（11.16±1.11）‰，与本研究测得的舟山渔场海域捕捞大黄鱼的数值一致。

表2 不同产地大黄鱼肌肉中稳定同位素比值δ13C、δ15N 和碳、氮质量分数Table 1 Stable isotope ratios of δ13C，δ15N and quality scores of C，N in muscles of L.crocea from different producing areas

2.3 主成分分析（PCA）

PCA 是数据处理中一种常用的线性降维方法，通过对复杂数据的降维处理，揭示隐藏在数据背后的简单结构，再通过正交变换将存在多重线性关系的高维数据映射为线性不相关的低维数据［31-32］。为更好探究元素及稳定同位素对大黄鱼产地判别的效率，选取矿物元素中质量分数差异显著的Mg、Al、K、Ti、Cr、Cu、Zn、Se、Sn、Ba 及稳定同位素δ13C、δ15N和C、N 作为变量进行主成分分析（见图1）。由图1知，散点图彼此无重叠，通过PCA 可区分4 种大黄鱼产地。图2 为元素在前2个主成分中的贡献图，元素越靠近相关圆表示其在PCA 中贡献率越大。结果表明，Mg、N、Se、Sn、C 这5个元素对主成分的贡献率较大，而δ15N 对主成分的贡献率较小。图3为主成分方差贡献率，其中，第1 主成分（PC1）占41.2%，第2 主成分（PC2）占22.9%，前6个主成分方差累计贡献率为90.5%，前6个主成分表达了大部分数据信息（图3（a））；依据各元素在主成分组件中的方差贡献率，得到对PC1 有重要贡献的元素为N、Mg、Se、C、K、δ13C、Ba（图3（b）），对PC2 有重要贡献的元素为Sn、Al、Ti、Cu、Cr、Zn（图3（c））。对4 种不同产地大黄鱼进行主成分分析，发现贡献较大的前5个元素分别为N、Mg、Se、Sn、C，贡献最小的为δ15N。

图1 不同产地大黄鱼PCA 中PC1、PC2 得分散点图Fig.1 The scatter plots of PC1 and PC2 in PCA of L.crocea from different producing areas

图2 元素在前2个主成分中的贡献Fig.2 Contribution of elements in the first two principal component analysis

图3 主成分方差贡献率Fig.3 Variance contribution rates of principle component

2.4 聚类分析（CA）

CA 是一种无监督的分类方法，按照组内样本之间相似度较高、组间样本之间相似度较低的原则，将样本归为不同类［33-34］。为更加直观地了解大黄鱼产地的分布情况，选取具有显著性差异的矿物元素Mg、Al、K、Ti、Cr、Cu、Zn、Se、Sn、Ba 及稳定同位素比值δ13C、δ15N 和C、N 作为变量进行CA，CA 中内部选用欧式距离算法，类间距离选用类平均法（图4）。从聚类距离（图中彩色处）处将树状图切割，可将大黄鱼样品分为5 类：第1 类全部为舟山渔场海域捕捞（n=10），第2 类全部为福建宁德养殖（n=10），第3 类为浙江温州养殖（3 条），第4 类全部为浙江舟山养殖（n=9），第5 类为浙江温州养殖（7 条）。结果表明，CA 法适合对4 种不同产地大黄鱼进行判别分析，而浙江温州养殖大黄鱼样本分为两类的原因可能是，其产地覆盖苍南、平阳和南麂岛等地，地域较为分散，使得该区域养殖的大黄鱼在稳定同位素比值和矿物元素质量分数上存在一定差异。

图4 不同产地大黄鱼CA 结果Fig.4 Cluster analysis results of L.crocea from different producing areas

2.5 Fisher 判别分析

Fisher 判别分析与PCA 是从不同角度对数据进行降维处理，PCA 是为了寻找方差尽可能大的维度，Fisher 判别分析是为了实现最大的类间距离以及最小的类内距离，利用已知类别的样本建立判别模型，对未知类别的样本进行分类［35-37］。目前Fisher 判别分析已应用于牛奶、三疣梭子蟹的产地溯源，具有较好的判别效果。为进一步探究矿物元素Mg、Al、K、Ti、Cr、Cu、Zn、Se、Sn、Ba，稳定同位素比值δ13C、δ15N 和C、N 在大黄鱼产地溯源中的应用效果，对4 种不同产地大黄鱼进行了Fisher 判别分析。从每个产地的10个样本中随机抽取3个作为测试集，得到12个测试集样本，测试集样本不参与Fisher 判别分析，用于对所建判别式的预测。其余28个样本作为训练集，建立判别式，进行判别分析。4 种不同产地大黄鱼的判别式分别为：

利用上述判别式预判测试集样本，各产地大黄鱼预判准确率为100%（表3）。为检验判别式的可靠性，采用“留一法”交叉验证进行检验，结果见表4。原始分类结果显示，整体判别率为100%，4 种样本准确判别率均为100%。“留一法”交叉验证结果显示，有85.7%的浙江舟山养殖大黄鱼样本被正确分类，14.3%的被误判为温州养殖大黄鱼，其余3 种大黄鱼样本均100%被正确分类。结果表明，所建立的判别式可对4 种不同产地大黄鱼样品进行正确分类，效果较好。

表3 不同产地大黄鱼测试集样本Fisher 判别结果Table 3 Fisher discriminant results of L.crocea from different producing areas

表4 Fisher 判别分析分类结果Table 4 Classification results of Fisher discriminant analysis of L.crocea

3 讨论

矿物元素在生态环境中的分布具有不均匀性，水、空气和饲料等不同物质的矿质元素组成各不相同，特征不同［38］。不同生境中的矿物元素又会通过生命活动进入其他生物体并持续累积，导致不同地区的生物体矿物元素含量存在较大差异［39］，利用这种微化学“指纹”差异可实现对农产品的产地溯源。目前基于矿物元素质量分数差异的分析已被用于鉴别不同产地或不同养殖方式的水产品［40］。本研究结果表明，在相同海域环境下，舟山渔场海域捕捞大黄鱼的Mg、Al、K、Ti、Se 和Ba 质量分数均显著高于舟山养殖大黄鱼，这与钟爱华等［41］研究得到的舟山海域放养大黄鱼Ca、Mg 和Se的质量分数高于舟山海域深水网箱和普通网箱养殖的结论相似。浙江舟山养殖大黄鱼和浙江温州养殖大黄鱼除在Mg、K 和Sn 质量分数上存在显著差异外，其余16 种元素的质量分数均无显著差异，这与两地地缘关系较近、海域环境相似和大黄鱼养殖模式相同有关。虽然福建宁德与浙江温州在地理位置上相距不远，但两地养殖的大黄鱼中Mg、Al、Ti、Cr、Cu、Zn 和Sn 这7 种元素的质量分数存在显著差异，可能与两地大黄鱼的养殖模式不同有关。目前我国大黄鱼养殖产量最高的福建，以普通网箱养殖为主（占92.8%），而浙江以深水网箱养殖为主（占85.9%），普通网箱养殖仅占7.92%，其余为围网养殖［42］。在不同养殖模式下，大黄鱼的生长环境和饵料来源有所不同。普通网箱养殖设置在近岸沿海，投喂冰鲜饵料或人工配合饲料；深水网箱养殖通常设置在靠近外海区域，具有一定潮流速，在获取投喂的冰鲜饵料或人工配合饲料的同时也能捕获一定的天然饵料；自然海域的大黄鱼则完全依靠天然饵料。此外，不同海域环境质量也存在一定差异，如徐亚岩等［43］指出，在我国四大海域的海洋沉积物中，重金属质量分数东海>黄海>渤海和南海。摄食结构及海域环境共同影响各产地大黄鱼矿物元素的累积。

生物体中13C、15N、2H和18O 等稳定同位素受摄食结构、气候环境、生长代谢类型等的影响，发生自然分馏效应［44］，从而可利用生物体稳定同位素自然丰度比值的差异进行农产品产地溯源［45］。水产品中的δ13C 与其摄食物来源密切相关，食物中C3、C4植物比例不同，δ13C 不同；δ15N 则受食物中动植物比例和环境状况等因素的影响［46］，由于在海洋生物中δ15N的富集程度较高，δ15N 值常被用于确定生物在食物网中的营养位置［47］。本研究发现，舟山渔场海域捕捞大黄鱼的δ13C和δ15N 值在4 种样品中均最高，这与其摄食物来源密切相关。受目前我国海洋渔业资源保护和禁捕规定等政策影响，大黄鱼养殖中逐渐用配合饲料替代冰鲜小杂鱼等鲜活饵料，因此自然海域捕捞的大黄鱼其动物性饵料摄入占比通常高于养殖大黄鱼，在深水网箱养殖中，由于天然饵料补充，使得其动物性饵料的摄入高于近岸普通网箱养殖，这也解释了δ15N呈舟山渔场海域捕捞大黄鱼>福建宁德养殖大黄鱼>浙江温州养殖大黄鱼和浙江舟山养殖大黄鱼的现象。另外，由于配合饲料中添加了大豆蛋白、豆粕等植物性碳源，使得养殖大黄鱼中的δ13C 值低于天然海域捕捞大黄鱼。本研究也发现，舟山渔场捕捞大黄鱼的高氮低碳现象可能与鱼的低脂肪、高蛋白质相关。由于自然海域野生大黄鱼为洄游性生物，生活在深海区，运动消耗能量较大，不利于脂肪积累；普通网箱养殖大黄鱼运动空间狭窄，且有充足的饵料，能量消耗低，很容易积累脂肪；深水网箱养殖的大黄鱼由于处于半开放性海域，潮流较急、活动空间较大，脂肪含量一般低于普通网箱养殖大黄鱼高于野生大黄鱼［12］。

4 结论

基于矿物元素稳定同位素比值和碳、氮元素的质量分数差异，结合PCA、CA 和Fisher 判别分析，对4 种不同产地大黄鱼进行了区分。方差分析表明，10 种矿物元素（Mg、Al、K、Ti、Cr、Cu、Zn、Se、Sn、Ba）、同位素比值δ13C、δ15N 和C、N 在不同产地大黄鱼间存在显著差异。利用元素及稳定同位素比值差异结合化学计量学分析手段，可有效区分大黄鱼产地，为解决大黄鱼产地溯源提供了一种有效可靠的方法。