基于超高效液相色谱—质谱技术血浆神经酰胺含量分析

刘 兵， 刘 岩， 李斯琪， 李红帅， 徐丽斯， 刘艳霞

国家老年疾病临床研究中心 北部战区总医院 老年医学中心 干二科，辽宁 沈阳 110016

神经酰胺是细胞膜的重要组分，是构成生物膜的主要磷脂，作为脂质第二信使参与细胞生长、增殖、分化、凋亡等信号转导过程，对细胞稳态起到重要作用；同时，其也是鞘磷脂信号途径的重要中间产物，对细胞之间的相互作用、胞内信号转导发挥调节功能[1-3]。有研究发现，作为代谢小分子的一种，神经酰胺在炎症细胞因子产生、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化等发生发展中发挥重要作用[4-5]。神经酰胺还是一种潜在的生物标志物，对预测疾病进展及预后具有临床应用价值。神经酰胺家族成员众多，但目前的研究中检测种类有限。针对神经酰胺的检测结果很少涉及同时分类检测组织或细胞内几种神经酰胺的含量[6]。本研究采用超高效液相色谱串联质谱法平台建立广谱的神经酰胺检测方法，可一次性检测多个神经酰胺种类，为全面解析神经酰胺在疾病中的作用奠定了基础。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂 超高效液相色谱仪(美国，Waters)；ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQD三重四极杆质谱仪(美国，Waters)；CV100-DNA真空离心浓缩仪(中国，北京吉艾姆)。全谱神经酰胺指标包含Ceramide 16:0(Cer 16:0)、Ceramide 18:0(Cer 18:0)、Ceramide 24:0(Cer 24:0)、Ceramide 24:1(Cer 24:1)；Cer 16:0-d7、Cer 18:0-d7、Cer 24:0-d7、Cer 24:0-d7为相应神经酰胺内标。色谱甲醇(美国，Merck)；色谱乙腈(美国，Merck)；甲酸(中国，阿拉丁)；乙酸铵(中国，麦克林)。

1.2 样本处理方法 10 μl血浆加入20 μl内标溶液，再加入570 μl甲醇，涡旋3 min以上，4℃、12 000 r/min离心15 min，取200 μl上清液进样分析。

1.3 色谱条件 选择两种色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50.0 mm，1.7 μm)和ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1×100.0 mm，1.7 μm)进行检测，其中，BEH C18(2.1×50.0 mm，1.7 μm)色谱柱峰型和峰强度更好。见图1。柱温：50℃；进样量：2 μl；流动相：5 mM乙酸铵水溶液(A相)～0.1%甲酸乙腈(B相)；梯度洗脱：0～1.0 min 85%～100%B，1.0～3.0 min 100%B，3.0～3.1 min 100%～85%B，3.1～5.0 min 85%B。

图1 BEH C18(2.1×50.0 mm，1.7 μm)色谱柱定量下限色谱图

1.4 质谱条件 采用电喷雾离子源正离子模式(ESI+)；毛细管电压：3.0 kV；锥孔电压：35 V；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：800 L/h；锥孔气：50 L/h；扫描方式：多重反应监测模式。各化合物的母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数见表1。

表1 多重反应监测模式模式下定量分析神经酰胺质谱参数

1.5 性能验证方法

1.5.1 浓度范围 将8个浓度水平的4种神经酰胺(Cer 16:0、Cer 18:0、Cer 24:0、Cer 24:0)校准品，按“1.2 样本处理方法”处理后，测定浓度并绘制曲线，以校准品的浓度为自变量x，峰面积比值y为纵坐标，求出线性回归方程，计算线性回归的相关系数r。

1.5.2 精密度和准确度 在同一天检测低、中、高3个浓度的质控品，每个浓度平行测定6次，计算不同浓度水平质控品的变异系数(coefficient of variation，CV)和相对偏差(relative deviation，Dev)作为批内精密度和准确度。连续检测3 d，每个浓度平行测定6次，计算不同浓度水平CV和Dev作为批间精密度和准确度。

1.5.3 回收率和基质效应 准确度采用加样回收试验评价，通过向血浆样品中加入不同浓度(同精密度和准确度浓度)标准溶液，计算回收率，评价准确度。基质效应是评价基质对被测物的影响，通过向血浆样品及空白基质(甲醇)中加入不同浓度(同精密度和准确度浓度)标准溶液，计算基质效应，每个浓度重复检测6次，按照“1.2 样本处理方法”处理样品。神经酰胺为内源性成分，因此需要扣除空白本底(空白标本重复检测6次，计算平均值作为空白本底值)，具体回收率(R%)计算公式如下：R% =(C加标检测值-C空白本底值)/C加标量×100%，要求各浓度回收率在85%～115%，低浓度点在80%～120%，CV<15%。具体基质效应(M%)计算公式如下：M% =(C血浆加标检测值-C空白本底值)/C空白基质加标量×100%。如果同一浓度，含基质的样本测定值/不含基质样本测定值在85%～115%则认为没有基质效应，如果低于85%则认为基质对被测物有抑制作用，相反，如果高于115%则认为基质对被测物有增强作用。

1.5.4 残留率 通过检测高值质控品标本检测后空白标本，连续反复6次，以空白标本的检测结果评价残留情况。要求高值质控品后的空白标本的测定值≤定量下限的20%，如果残留不可避免，可在高值质控品标本后增加空白溶剂，以确保不响应准确度和精密度。

2 结果

2.1 标准曲线实验结果 4种神经酰胺的相关系数r值均大于0.99，呈良好线性关系，且具有很宽的线性范围，Cer 16:0、Cer 18:0在10.0～2 000.0 ng/ml浓度范围内呈良好线性关系，Cer 24:0、Cer 24:1在0.1～20.0 μg/ml浓度范围内呈良好线性关系。见图2。

图2 标准曲线实验结果

2.2 精密度、准确度及回收率、基质效应实验结果 4种神经酰胺的3个浓度质控品的批内和批间CV≤15%、Dev≤±15%，检验结果均满足性能验证要求，说明该方法精密度和准确度良好。各浓度平均回收率均在92.20%～111.58%之间，说明该方法准确度较好。各浓度基质效应在92.69%～98.90%之间，说明基质对被测物无影响，满足实验要求。见表2。

表2 精密度、准确度及回收率、基质效应实验结果

2.3 残留实验结果 高值质控品后的空白标本的测定值均≤定量下限的20%，残留较少，满足实验要求。见表3。

表3 残留实验结果

3 讨论

血浆中神经酰胺水平是预测心血管事件的重要因子，既往研究证实，神经酰胺可作为多种类型疾病的潜在生物标志物[7]。建立一个神经酰胺的检测平台对多种疾病的研究都具有重大意义，有助于提高对疾病诊断、分型及预后评估的能力。在基于冠心病患者的研究中，神经酰胺亚型(Cer 16:0、Cer 18:0、Cer 22:0、Cer 24:0、Cer 24:1)被发现与斑块不稳定[8]、不良心血管事件[9]及远期预后[10]相关。

目前，神经酰胺的检测方法主要有薄层色谱法、 高效液相色谱法、质谱法及高效液相色谱法—质谱法等。其中，高效液相色谱法是分离神经酰胺的主要技术，但其前期处理复杂，耗时长，存在灵敏度和分辨率不高的缺陷，增加了实验的难度和误差。而质谱法虽然灵敏度高、所需样品少，且用时较短，但由于可能出现质量数重叠的脂质分子之间的相互干扰，常导致检测特异性不佳[11-13]。本研究研发了一种基于美国Waters超高效液相色谱仪和ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQD三重四极杆质谱仪系统的联机检测方法，同时检测Cer 16:0、Cer 18:0、Cer 24:0、Cer 24:1这4种神经酰胺的含量。为了选择合适的色谱柱，本研究选择了两种色谱柱进行检测和质谱等条件的优化，BEH C18(2.1×50.0 mm，1.7 μm)色谱柱峰型和峰强度更好，最终选定的色谱条件为以BEH C18(2.1×50.0 mm，1.7 μm)为分析色谱柱，柱温50℃，流动相A为5 mM乙酸铵水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈，梯度洗脱。采用电喷雾离子源正离子模式(ESI+)；毛细管电压：3.0 kV；锥孔电压：35 V；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：800 L/h；锥孔气：50 L/h。扫描方式为多重反应监测模式。通过标准曲线、精密度、准确度、回收率、基质效应、残留实验等参数进行性能评估，结果显示，本研究方法的准确度和精密度均不劣于既往研究[14]，且每个样品分析仅需20 min左右，与邱丽萍等[15]研究结果比较，具有较高的分析效率，适用于大批量样品的定量分析。

本研究结果显示：4种神经酰胺的相关系数r值均大于0.99，呈良好线性关系，且具有很宽的线性范围，Cer 16:0、Cer 18:0在10.0～2 000.0 ng/ml浓度范围内呈良好线性关系，Cer 24:0、Cer 24:1在0.1～20.0 μg/ml浓度范围内呈良好线性关系；4种神经酰胺的3个浓度质控品的CV≤15%、Dev≤±15%，优于可接受范围(±20%)，说明该方法精密度和准确度良好；平均回收率均在92.20%～111.58%之间，基质效应在92.69%～98.90%之间，说明该方法准确度较好，受基质影响小；高值质控品后的空白标本的测定值均≤定量下限的20%，残留较少，满足实验要求。

综上所述，采用超高效液相色谱串联质谱法同时测定不同类型神经酰胺的方法精密度和准确度高，重现性好，可作为检测血清中不同类型神经酰胺含量的工具。