分子检测在细胞学不确定甲状腺结节诊治中的应用研究进展

傅晓凤 司星 董荷琴 朱江

近年来，甲状腺癌的发病率在全球范围内不断上升[1]。目前，超声检查是各国甲状腺协会指南推荐的甲状腺非侵入性检查首选方法[2]，超声引导下细针穿刺活检（fine-needle aspiration,FNA）因具备较高的灵敏度和特异度，已作为甲状腺结节术前诊断的有效手段被广泛应用于临床实践。尽管如此，仍有大约20%～30%的甲状腺结节因为缺乏特征性的细胞学征象而导致误诊或者不能明确诊断[3-4]。根据Bethesda系统，这些细胞学不确定（indeterminate cytology,IC）结节主要分为3类：意义不明确的细胞不典型病变/意义不明确的滤泡性病变（atypia cells of undetermined significance/follicular lesions of unknown significance,AUS/FLUS）、滤泡性肿瘤或可疑滤泡性肿瘤（follicular neoplasm/suspicious follicular neoplasm,FN/SFN）、可疑恶性肿瘤（suspicious malignancy,SM）[5]。这3类患者多数会被推荐进行再次FNA或者甲状腺诊断手术，导致部分良性甲状腺结节患者经历不必要的手术，同时面临手术并发症的风险；另外，对于许多甲状腺癌的患者来说，诊断性手术无疑是一种不理想术式，具有需要二次甲状腺切除手术的风险。所以，对于诊断为IC结节的患者，在术前对其良恶性及风险程度作出精准诊断至关重要，这样可以优化手术方式和术后管理方案，最大限度地减少过度治疗，降低医疗成本。然而，仅通过目前的超声检查及FNA等常用诊断工具不能够满足临床及患者的需求，因此，甲状腺结节的精确诊断及分层管理仍是一个亟待解决的临床问题。2015年，美国甲状腺协会以及其他临床内分泌学团体肯定了分子检测在甲状腺结节诊断中的的作用，建议当甲状腺结节术前FNA无法确诊时，可以使用分子检测进行补充诊断[6]。目前分子检测技术层出不穷，但这些分子检测方法的效能是否能提高诊断准确性并帮助患者制定个性化的治疗方案是当前临床较为困惑的问题。现就多种甲状腺结节分子检测工具及应用研究进展作一综述。

1 甲状腺分子标志物的研究进展

在过去的几十年里，研究者们对甲状腺癌遗传机制的深入理解及高通量基因型分析技术的应用，使得甲状腺癌分子标志物的研究有了显著的进展，许多甲状腺癌基因驱动事件被发现。

20世纪90年代，研究者们首次证实甲状腺结节FNA样本可提供足够数量的细胞用于检测单个点突变[7]或基因融合[8]，21世纪初BRAF基因突变的发现使得单基因突变标志物检测达到临床应用的水平[9]。最常见的BRAF V600E突变对甲状腺癌尤其是甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）的鉴别具有很高的特异度及阳性预测值[10]。尽管如此，鉴于肿瘤的异质性，许多甲状腺癌是由其他基因突变所驱动，仅对BRAF进行检测无法提供足够高的阴性预测值。突变基因panel的开发则提高了分子检测的灵敏度。Nikiforov等[11]设计了7基因panel（包括BRAF V600E、HRAS、KRAS、NRAS、PAX8/PPARG、RET/PTC1、RET/PTC3）用于检测IC结节，结果表明该panel显著提高了甲状腺癌诊断准确性。近年来，基于微阵列芯片技术、下一代测序（next-generation sequencing,NGS）技术的肿瘤研究和临床实践的分子检测正在迅速发展，为甲状腺结节的精确诊断及分层管理迎来新的机遇。

2 分子标志物检测技术

2.1 基于基因表达检测

2.1.1 Afirma基因表达分类器（gene expression classifier,GEC）检测 Afirma GEC基于微阵列芯片分析技术对167个基因的转录物表达水平进行检测，包括用于鉴别结节良、恶性的142种基因及用于筛选罕见肿瘤（例如嗜酸细胞性肿瘤、转移性甲状腺癌等）的25种基因[12-13]，检测结果报告为“良性”或“可疑恶性”。Alexander等[13]应用Afirma GEC对分类为AUS/FLUS、FN/SFN的IC结节进行诊断，其灵敏度达0.90，阴性预测值为0.94～0.95，而特异度为0.49～0.53。因此，Afirma GEC可作为“rule-out”检验用于识别IC结节中的良性结节。相比之下，Afirma GEC阳性患者恶性肿瘤概率仅37%～38%，所以尚不适用于确诊甲状腺癌。而Papoian等[14]研究提出，具有癌症高风险因素的IC结节（如同时患有桥本甲状腺炎）的患者在接受Afirma GEC结果时要谨慎，该研究中71%Afirma GEC阴性患者经病理检查证实为甲状腺癌，研究者认为使用该检测手段很可能影响患者对结节的及时干预。此外，有研究指出Hürthle细胞优势结节在Afirma GEC测试中具有较高的假阳性率，报告为“可疑恶性”结节的实际恶性风险较低[15]。因此，Afirma GEC在不同人群中的实用性是有限的，在选择时应综合考虑。

2.1.2 Afirma基因测序分类器（gene sequencing classifier,GSC）检测 Afirma GSC检测利用生物信息分析和机器学习策略评估共10 196个基因的RNA表达水平、细胞核及线粒体RNA转录水平及基因组拷贝数的变化。除此之外，针对特定和罕见的患者亚组并进一步提高检测分类性能，Afirma GSC系统还加入了其他7个组分：甲状旁腺分类器、甲状腺髓样癌分类器、BRAF V600E及RET/PTC1和RET/PTC3融合检测、滤泡含量指数、Hürthle细胞指数和Hürthle肿瘤指数分类器[16]。一项前瞻性、大样本、多中心的研究结果显示Afirma GSC诊断BethesdaⅢ/Ⅳ类结节的灵敏度为0.91，特异度为 0.68，其特异度较 Afirma GEC（0.50）显著提高，这表明至少多1/3以上的患者使用Afirma GSC检测可获得良性结果，提示更多的患者可采取主动观察策略，而非诊断性手术[16]。另有研究表明，在诊断Hürthle细胞病变结节中，Afirma GSC的良性呼叫率（benign call rate,BCR）显著高于GEC（88.8%对25.7%，P＜0.01），采用GSC检测使IC结节的手术干预率下降了66.4%[17]。总的来说，Afirma GSC是一种性能更佳的“rule-out”测试，在保持高灵敏度和阴性预测值的同时具有高特异度和阳性预测值，且在评估Hürthle细胞病变结节中更具优势。

2.1.3 Afirma Xpression Atlas检测 目前，在甲状腺IC结节中，Afirma GSC报告“阴性”的结节（癌症风险约4%）可以考虑临床观察而非行诊断性手术；而Afirma GSC报告“阳性”的结节（癌症风险约50%）通常需要考虑手术治疗[17-18]。因此，为进一步确定结节的恶性风险，Veracyte公司最早于2018年3月推出Afirma Xpression Atlas(XA)检测方法，采用全RNA测序技术检测基因突变与融合。2020年3月更新的Afirma XA主要检测593个甲状腺癌相关基因的905种突变和235种融合，包括104个新鉴定或罕见的基因融合位点，这些位点均含靶向特异性激酶抑制剂[19]。一项大样本研究应用Afirma XA检测Afima GSC可疑BethesdaⅢ/ⅣFNAs、BethesdaⅤ、BethesdaⅥ FNAs及 MTC 分类器阳性FNAs，结果显示44%、64%、87%及70%的结节存在至少1处基因突变或融合，这或将进一步优化患者个性化治疗方案，包括靶向药物的应用[20]。最新研究数据表明，Afirma XA可能为可疑AUS/FLUS、SFN、SM和恶性结节及甲状腺癌转移患者提供关于肿瘤组织学、临床特征、癌症行为（包括转移模式）、预后相关预测，并且在适当的临床环境中对患者靶向治疗的选择具有潜在帮助[20-21]。

2.2 基于基因突变、基因融合检测 NGS又称高通量核苷酸测序技术，因其技术成熟、费用低及实验周期短等特点，已被广泛应用于科学研究和疾病的临床诊断中。对于甲状腺结节，NGS可以利用FNA获得的细胞进行大规模基因组序列的测定。

2.2.1 ThyroSeq v2.0 有研究基于NGS技术设计了ThyroSeq v2.0基因包，用于检测甲状腺癌相关的14个基因的点突变和小的插入/缺失，42种类型的基因融合以及16个基因表达水平，它不仅用于甲状腺乳头状癌的检测，还包括对甲状腺髓样癌和甲状旁腺疾病的检测[22-23]。一项回顾性和前瞻性队列的研究[23]应用ThyroSeq v2.0检测FN/SFN结节的综合灵敏度、特异度、阴性预测值、阳性预测值分别为0.90、0.93、0.83、0.96，准确度为0.92，提示该检测可对FN/SFN进行有效分层并能优化对患者的管理，尽管其中4例病理检查结果为恶性的结节未检出任何突变，但进一步评估发现这些结节均不具有侵袭性组织学特征，因此，在排除结节超声高风险特征和既往放射暴露史或甲状腺癌家族史等前提下，利用ThyroSeq v2.0对结节进行检测，未检出突变者可提示临床优先选择主动监测。此外，若ThyroSeq v2.0诊断结节存在低水平突变但不足以诊断为阳性时则需要密切的随访、再次FNA或再次分子检测以监测突变克隆在结节内的发展。一项多机构研究分析发现，ThyroSeq v2.0诊断BethesdaⅢ/Ⅳ类结节的阳性预测值不稳定且低于预期，这取决于恶性肿瘤患病率的差异或者病理学家对非侵袭性肿瘤突变的解释，提示ThyroSeq v2.0的性能或因临床实践环境的不同而异[24]。

2.2.2 ThyroSeq v3.0 根据近年来在不同类型甲状腺癌中新的驱动突变和基因融合的发现，ThyroSeq v3.0通过扩大现有检测、纳入新的分子标记物以进一步提高诊断效能。该检测采用DNA和RNA靶向NGS技术分析了112种甲状腺癌相关基因突变，120余种类型的基因融合，19个异常的基因表达变异以及FNA样本中的10个基因组区域和组织样本中多达27个基因组区域的拷贝数变异[25]。用于ThyroSeq v3.0检测的样本可以是核酸保存液中的新鲜甲状腺FNA样本，也可以是甲醛固定-石蜡包埋的甲状腺组织[26]。在一项双盲的前瞻性多中心队列研究中，ThyroSeq v3.0对BethesdaⅢ/Ⅳ类结节的检测显示出高灵敏度（0.94）和阴性预测值（0.97），以及较高的特异度（0.82）和阳性预测值（0.66），使多达61%患者避免诊断性手术，且有助于为检测结果阳性的患者制定个性化治疗方案，这使研究结果得到了进一步的验证[25，27]。此外，ThyroSeq v3.0还致力于在Hürthle细胞病变甲状腺结节中实现稳健的测试效能，研究结果显示ThyroSeq v3.0检测Hürthle细胞病变结节的灵敏度达0.929，特异度为0.693[25]。

2.3 基于miRNA检测 miRNA是长度约19～23个核苷酸的单链非编码小型RNA片段，通过干扰蛋白表达参与增殖分化和凋亡调控，导致翻译抑制或靶点降解和基因沉默[28-29]。越来越多证据表明，miRNA的失调与癌症相关，包括甲状腺癌[30-31]。

2.3.1 ThyraMIR/ThyGenX（MPT） 有研究表明，结合基因突变和miRNA分析可以提高甲状腺病变的检测[32]，MPT正是基于该优势构建的一个商业化检测模型[33]。通常MPT检测分为两步，一是ThyGenX通过靶向NGS检测与甲状腺病变相关的5个基因突变（BRAF、KRAS、HRAS、NRAS、PIK3CA）和 3 种常见的基因融合（RET/PTC1、RET/PTC3、PAX8/PPARG），结节携带 BRAF突变，RET/PTC1、RET/PTC3基因融合时几乎100%提示PTC可能，提示临床选择甲状腺全切手术作为首选术式。当ThyGenX检测阴性或仅检测到RAS、PIK3CA突变及PAX8/PPARG基因融合时，则引入ThyraMIR，该检测通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测10个代表性miRNA的表达水平，并采用专有算法将结节划分为高、低风险[34]。一项多中心横断面队列研究显示[33]，在ThyGenX检测阴性时，ThyraMIR检测准确地诊断了64%恶性患者和98%良性患者，MPT诊断 AUS/FLUS、FN/SFN的灵敏度和特异度分别为0.89、0.85，有效提高了良性结节的检出率，并将诊断性手术率降低了69%，这提示MPT多平台联合检测可提高分子细胞学诊断率，进一步完善甲状腺IC结节的术前风险评估和管理。

2.3.2 ThyraMIR/ThyGeNEXT（MPTX） MTPX 检测包括ThyGeNEXT突变panel和ThyraMIR miRNA风险分类器检测。与ThyraGenX相比，ThyGeNEXT扩大检测了TERT和RET原癌基因突变（提示结节侵袭性），PTEN、GNAS基因突变检测以及更新的可能作为治疗靶点的融合突变位点，即NTRK和ALK融合。MPTX检测结果包括MPTX测试状态（阴性或阳性）和临床风险分类（低、中、高风险）[35]。一项双盲、多中心的研究结果表明MPTX诊断BethesdaⅢ/Ⅳ类结节的灵敏度为0.95，特异度为0.90，阴性预测值为0.97，阳性预测值为0.75[36]。Sistrunk等[35]对140例AUS/FLUS或FN/SFN患者进行MPTX检测：MPTX测试阴性和低风险结果提示患者保持无癌生存的概率达94%；MPTX阳性和中风险是提示恶性的重要危险因素，恶性概率均为53%；MPTX高风险提示恶性肿瘤风险增加，概率为70%。以上证据均表明MPTX检测可提高IC结节的诊断准确率并预示潜在的侵袭风险。MPTX对风险类别的进一步分类提高了该检测的临床实用性。

2.3.3 RosettaGX Reveal RosettaGX Reveal甲状腺分类器通过检测24个miRNAs的表达将IC结节分类为良性、可疑恶性或髓样癌。最早的多中心盲法验证队列来自Lithwick-Yanai等[37]，在189例细胞学诊断为AUS/FLUS、FN/SFN 的结节中，RosettaGX Reveal检测的灵敏度为0.85，特异度为0.72，阴性预测值为0.91，阳性预测值为0.59。一项回顾性三机构研究中，Walts等[38]比较了81个IC结节中RosettaGX Reveal和Afirma GEC的表现，与组织学随访结果相比，Reveal总体分类准确率为64.2%，Afirma GEC为28.4%，此外，在26个良性 Hürthle细胞病变的分类应用中，Reveal表现也优于Afirma GEC。RosettaGX Reveal可直接利用染色后的细胞学涂片进行RNA检测，不要求采用新鲜组织或特殊的采集、保存和运输条件。

3 总结

甲状腺IC结节的诊疗是临床工作中一大难点，相关的分子检测目前正迅速发展，从单基因检测、多基因panel突变分析到结合基因融合、microRNAs、基因拷贝数变异等，均显示了检测方法的多样性。本文综述了各类分子检测方法及其性能特征的差异，有助于患者及医生根据临床实践环境做出合适的选择并制定个性化的治疗方案。现有的临床研究数据表明分子检测在降低甲状腺结节诊断的不确定性方面有巨大的应用前景。然而，检测结果良性的甲状腺结节仍需要长期随访以评估这些检测方法的假阴性率。此外，各类分子检测只提示结节良、恶性的可能性以及风险程度，对于其结果的解释及结节的管理还应综合超声检查、细胞学检查、临床评估等。目前的研究多为回顾性研究，今后需要开展更多的前瞻性、多机构中心联合的研究，以进一步了解这些分子检测方法的性能及临床效用，发展更个性化的甲状腺结节诊断和管理策略。