纳米抗体在非洲猪瘟检测中的应用

王赛楠，安天赐，何 健，石建州

（南阳师范学院生命科学与农业工程学院，河南 南阳 473061）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起猪的急性、高度接触性、高病死率的烈性传染病[1]。世界动物卫生组织（OIE）将非洲猪瘟列为法定通报动物疫病，我国将其列为一类动物疫病[2]。迄今为止，针对非洲猪瘟尚无有效的疫苗和药物可以使用，它的流行和传播会给养猪业造成毁灭性打击[3]。目前对抗非洲猪瘟的主要措施是检测和扑杀[4]。自1921年肯尼亚首次暴发ASF以来，疫情已蔓延扩散至非洲、欧洲、美洲和亚洲地区，初步呈现出扩大流行的态势。我国自2018年8月3日在沈阳市确认首例ASF以来[5]，疫情快速蔓延至全国各地。

纳米抗体（Nanobody，Nb）是在骆驼、羊驼和鲨鱼血清中发现的一种结构简单、分子量小的新型抗体，具有低免疫原性、稳定性高、特异性高、亲和力高、组织渗透性强以及可识别抗原缝隙表位、易于改造、易于制备、成本低廉等特点，在疾病诊断方面具有广阔的应用前景。

1 非洲猪瘟病毒检测方法的研究进展

1.1 非洲猪瘟概述

ASFV是一种巨大而复杂、有囊膜的DNA病毒，属于非洲猪瘟病毒科 （Asfarviridae）、猪瘟病毒属（Asfivirus）的唯一成员，也是目前唯一已知的虫媒DNA病毒[6]。病毒粒子系由3万多个蛋白亚基组装成的直径为260～300 nm的球状颗粒[7]，具有与核质大DNA 病 毒 （Nucleocytoplasmic large DNA viruses，NCLDV）超家族相同的结构、基因组和复制特性。A SFV编码的蛋白组装成了五层结构[8]，内核芯壳（Core shell）、内膜（Inner envelope）、核衣壳（Capsid）、外囊膜（External envelope）从内到外依次将病毒基因组（Nueleoid）多层包裹，呈二十面体对称结构形态[9]。其蛋白包括结构蛋白在内至少有54种，尚有非结构蛋白100多种[10]。其抗原也表现为多样性[11]，参与ASFV基因组的复制、修复、转录、组装以及免疫逃逸等生物过程[12]。

ASFV能够长时间稳定存在于环境中，在猪科动物间高效易感传播。家猪、野猪和软蜱为ASFV的天然宿主和传播媒介[13]。各年龄段的猪均可感染。基于感染不同毒力的毒株，其临床症状表现为四种类型[14]。最急性型；受强毒株感染，患病猪无明显的临床症状而突然死亡，死亡率达100%；急性型：受强毒株感染，病程为4～10 d，出现高热和出血症症状，病死率达100%；亚急性型：受中等毒力毒株感染，症状与急性型相似但较轻，病程为5～30 d，仔猪死亡率高；慢性型；受低毒力毒株感染，病程为2～15个月，患病猪出现波状热、呼吸困难、生长缓慢、皮肤溃疡以及关节肿胀等症状。

2021年初我国出现了基因II型自然变异流行株，其基因组序列均发生不同程度的改变（核苷酸缺失、突变、插入或短片段替换等）[15]。 ASFV变异株毒力较为温和，但残存毒力传染性很强。临床表现不明显，隐蔽性强，检测难度大，使得疫情更加复杂难控[16]。因此，早期诊断和准确快速检测，是ASF防控体系构建中的关键环节[17]。

1.2 非洲猪瘟病毒的检测方法

目前常用的检测方法包括病毒分离、核酸和蛋白水平检测。

核酸水平检测即分子水平检测，蛋白水平检测即免疫学检测。病毒分离和核酸检测属于抗原检测，是检测急性期或病程初期感染病毒以及开展潜伏期诊断的有效方法。蛋白水平检测主要是检测抗体，包括酶联免疫吸附试验ELISA、免疫荧光和免疫层析试纸等方法。

1.2.1 病毒分离。病毒分离是鉴定ASFV的金标准，需要在P3实验室进行。首先采集临床疑似感染猪的血液、脾脏和淋巴结等组织，分离病毒，其后接种于猪源原代细胞、巨噬细胞和单核细胞内。ASFV在干细胞中复制增殖，出现红细胞吸附现象48～72 h后，若发生细胞病变（CPE），则说明检测样品中存在ASFV。若细胞分离无变化，或荧光抗体试验和PCR检测呈阴性，则需再次接种，传代3～5代，才可确认样品为ASFV阴性。可以说病毒分离是分子生物学研究的基础[18]。病毒分离的缺点是操作繁琐，鉴定周期较长，需要其他辅助检测方法参与判定。

1.2.2 核酸水平检测方法。聚合酶链式反应PCR。基于多聚酶链式反应PCR的核酸检测技术是最常用的ASFV实验室检测方法，其操作简便快捷、灵敏度高、特异性强，是国际贸易中OIE指定的ASFV检测方法。PCR是替代病毒分离鉴定的一种快速、灵敏、特异的ASFV检测技术。相比于酶联免疫吸附试验（ELISA）有着更高的特异性与敏感性。PCR方法对病原核酸纯度要求不高，适用于检测不适合进行病毒分离的腐败组织或血液样品。能够实现早期诊断，是非疫区检测疫病的重要手段之一，尤其适用于鉴定体外分离不到的病原。普通PCR可用于ASF的监测和诊断[19]。该检测方法的缺点是容易发生交叉污染和依赖仪器设备。荧光定量PCR（quantitative Real-time PCR，qPCR）是将PCR与光谱进行结合的核酸定量检测技术，具备传统PCR的特异、灵敏、快速的特点和光谱技术的高灵敏性和高精确定量的优势，高效、无需电泳检测扩增产物，自动化程度高、闭管操作交叉污染概率低，避免了假阳性结果。qPCR包括探针法和染料法[20]。KING[21]等建立的针对ASFV-p72基因序列的qPCR，其引物和探针需经OIE认证。MCKLLEN[22]等建立的分子信号实时PCR灵敏度高，可鉴别诊断与ASFV症状相似的猪瘟。2019年初，中国农业农村部公布了第一批ASF现场快速检测试剂和11种病原学检测试剂盒，其中60%以上是采用qPCR方法，部分产品的敏感性和特异性达到100%。qPCR方法的显著优势在于能够实时检测反应过程，测定模板的绝对量。不足之处在于容易出现假阳性，且对引物或探针要求高[23]。病原检测可采用P72/CD2v/MGF或P72/EGFP/mCherry三重实时荧光定量PCR方法检测病毒核酸。对不常见的基因变异且具有特殊临床症状的样品，需再进行全基因组测序鉴别[17]。环介导等温扩增检测技术LAMP，该技术无需高温变性、无需温度循环、无需电泳、无需紫外监控，操作简便、检测时程短、反应快速精确、特异性更高、结果判定直观且成本低廉，较适用于现场检测。缺点是容易造成气溶胶污染，形成假阳性结果。环介导等温扩增技术（Loop mediated Isothermal Amplification，LAMP）作为一种灵敏高效、特异性强的基因扩增方法，检测不依赖于设备，能满足基层现场的快速使用[23]，其为疫情监测提供了一种便捷、准确、低成本的选择[25]。

1.2.3 蛋白水平检测方法。主要包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光试验（IFA）和免疫层析试纸。

酶联免疫吸附试验 (Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)作为实验室常用的免疫学检测方法，有抗原检测和抗体检测2种，其中抗体检测是国际贸易中OIE指定的ASF首选血清学诊断方法。其基本工作原理是通过与酶分子共价结合的抗体和吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合，在底物溶液存在的情况下，由酶分子催化发生颜色反应[26]。 采用《非洲猪瘟诊断技术》（GB/T 18648）规定的间接ELISA，阻断ELISA等方法进行抗体检测[17]。ELISA具有高灵敏度、强特异性、可使用自动化设备检测大量样本、操作方便的特点。该方法要求操作人员具备一定的专业技术，且必须依赖仪器设备判断试验结果，试验时程长。ELISA方法可通过ASFV常用的靶标抗原 P73、P72、P54、P32/P30 等直接检测出感染猪抗体[27]。检测抗原的成本低于PCR，在无特殊仪器设备的实验室，可以实现在短期内进行大规模筛查。同时，可以辅助病毒学和血清学检测[28]。ELISA主要适用于亚急性和慢性ASF的诊断。当ELISA检测结果不确定或者制备抗原出现困难时，可选用IFA血清学检测方法复核[29]。

间接免疫荧光试验（IFA）。基于免疫学、生物化学和显微镜技术的间接免疫荧光抗体试验（Indirect fluorescence antibody test，IFA），系利用抗原抗体作用以定位细胞和细胞内抗原物质的一种方法[30]。该方法的特异性好、灵敏度高、成本低，但需要具备培养细胞的试验条件和荧光显微镜等设备。

免疫层析试纸。此为基于单克隆抗体、免疫层析、免疫标记以及新材料等而发展出的一种简便快速的新型免疫学检测技术 （Immunochromatographic lateral flow strip test，ILFST）， 又 称 侧 流 免 疫 检 测 技 术（Lateral flow immunoassay，LFA）。 采用该技术无需专业技能，不依赖仪器，便携性好、使用便捷、检测迅速、结果判定简易、干扰小、成本低[31]。随着纳米粒子与显色手段的发展，目前免疫层析试纸已不局限于胶体金试纸[26]。采用最新研发的ASFV血清抗体量子点荧光检测试纸条，配合手持式荧光免疫分析仪，可将高敏感性的量子点标记技术与侧向流免疫层析技术相结合，实现了ASF抗体的现场实时POCT检测[32]。

不同的检测方法具有不同的特点，在现场检测中选用哪一种检测方法需要在比较每种方法的优缺点和适用情景后做出取舍[23]。

2 纳米抗体

纳米抗体（Nanobody，Nb）作为抗体的新成员，近年来在医药检测和治疗领域的发展较为迅速。Nb较传统的单克隆抗体有着更加优越的应用前景，可以克服传统单克隆抗体制备成本高、工艺复杂，以及难以人工改造等缺点。

2.1 纳米抗体的结构特征

传统的IgG由两条相同的重链和两条相同的轻链构成，重链间、重链与轻链间通过二硫键连接，重链和轻链由可变区和恒定区组成，相对分子量约为150 kDa。纳米抗体是在骆驼、羊驼和鲨鱼体内发现的一种结构特别的抗体，与传统IgG相比，Nb体积小，呈椭圆形，通常包括骨架区和互补决定区，为凸型结构，利于与抗原结合。故Nb特异亲和力更高。单链抗体缺少轻链和重链CH1，只含有重链CH2、CH3和可变区。抗原结合部分仅由重链可变区构成，尺寸约是传统抗体的1/10。 Nb主要依靠 3个互补决定区（CDR1，CDR2，CDR3）与抗原分子结合，其氨基酸序列突变性较强。高变区之间骨架区的氨基酸序列变化较小[33]。

2.2 纳米抗体的生物学特性

Nb结构简单、体型小，相对分子量约为15 kDa，较小的分子量和体积使其具有较好的组织穿透力。Nb溶解度高，在于Nb骨架区FR2中的疏水氨基酸残基突变为亲水氨基酸残基，因而增加了Nb的溶解性[34]。Nb稳定性强、易于保存，对极端条件具有一定的抵抗力。Nb在37℃下可保存1周，在-80℃低温下可长期保存，甚至可以承受90℃的高温、高压以及较宽范围的pH条件[35]。Nb抗原结合能力强，具有较长的CDR3，能够形成稳定的凸型结构，更易于进入抗原结构的内部结合隐蔽的位点[36]。为进一步降低Nb的免疫原性，可将特定Nb的CDR移植到人源化的支架上，获得低免疫原性的Nb[34]。

2.3 纳米抗体在免疫检测中的应用

由于Nb结构功能的独特性和优越性，因而受到广泛关注，且已在疾病检测治疗方面得到应用。Nb在ELISA、荧光免疫技术、免疫层析技术、电化学发光免疫分析等免疫学检测中有着良好的应用前景[37]。利用禽戊型肝炎病毒 （avian Hepatitis E virus,a HEV）ORF2截短蛋白特异性Nb建立的竞争ELISA检测方法，减少了HRP标记的二抗的使用，缩短了检测时间，简化了操作流程。理论上能够检测所有基因型的禽HEV，可广泛应用于鸡群禽HEV感染的血清学调查[38]。

3 纳米抗体在非洲猪瘟检测中的应用及展望

Nb是天然缺失轻链和重链第一恒定区的一种单链抗体，分子量小、体积小、溶解性好、结构稳定、特异性高、易于基因改造，并具有易于用细菌大量表达生产等优势，相较于传统的单抗，Nb在诊断方面更具有开发价值[33]。

监测ASFV的流行动态，最终实现ASFV的净化，迫切需要提高检测水平。纳米抗体在ASFV检测中的应用尚处于起步阶段。目前以ASFV p30、p54和p72蛋白的纳米抗体与HRP的融合蛋白为检测抗体，已成功建立了ASF疫病抗体的新型竞争ELISA检测方法，可用于猪血清中抗体的检测。该方法操作简单（无需使用酶标二抗）、便捷，敏感性强，特异性高和生产成本低，具有良好的市场开发前景[39-40]。