七叶树组织培养初步研究

李建兵,包卫东

(1.甘肃省小陇山林业调查规划院,甘肃 天水 741020；2.甘肃省小陇山林业实验局 ,甘肃 天水 741020)

七叶树(学名：AeculuschinensisEunge)，为甘肃省珍稀频危省级保护树种之一，在中国秦岭西段的小陇山林业实验局林区多有分布。七叶树是著名观赏树种，同时，还具有药用及经济价值，可供小工艺品及家具等用材。通过运用组织培养快繁技术，使其不仅具有遗传性状相对稳定、增殖快、繁殖系数高、产量高、品质好、生产周期短等特点，而且受气候、季节影响小，便于操作，可节省大量人力物力。笔者参与了七叶树组织培养工作，并对该技术进行了初步研究，归纳总结了一些成熟的做法和结论，以便在生产实践中予以推广应用。

1 实验原理

通过对茎尖材料的无菌培养，研究器官分化和在离土培养条件下培养材料(外植体)的生长发育规律，以及影响这些过程的各种因素。

2 实验设施

2.1 无菌操作室

无菌操作装置是接种箱(超净工作台)，内附空气过滤系统、光照系统、紫外灯。

2.2 培养室

七叶树组织和细胞培养室里，需要具有照明和控温设备，为七叶树外植体生长及发育提供所需要的环境，比如温度、湿度、光照、通风等。一般要求温度在25±1℃之间。光源一般采用白色荧光灯或自然光线，每天光照约16h，光强为200001x左右。还需要配备有常用的培养架，用于固体培养。

2.3 组织培养所需的各种用具

(1)三角瓶或烧杯(100ml，250ml，500ml，1L)；(2)玻璃搅拌棒；(3)冰箱；(4)空调；(5)牛角勺；(6)剪刀；(7)器械架；(8)纯水水桶；(9)量简(25lm，50ml，100ml，1L)；(10)容量瓶(100ml，500ml，1L)；(11)刻度移液管(1kl，2ml，5ml，10ml)；(12)药物天平；(13)磨砂口玻璃瓶； 用来对植物材料进行表面灭菌。(14)酒精灯；(15)无菌滤纸 ；(16)高压灭菌锅或家用乐力锅；(17)可调式电炉；(18)酸度计；(19)镊子；(20)解剖刀；(21)培养皿；(22)锥形瓶；(23)室内小推车。

2.4 器皿和器械消毒

为了能够彻底灭菌，将七叶树玻璃培养器皿和培养基分开进行，先对培养容器用高压蒸汽灭菌法消毒，再对培养基用常规法灭菌，也可将它们置于烘箱中在160℃～80℃下干热处理3h。无菌操作中使用的各种器械都必须进行消毒，方法是：将它们依次放在95%酒精中浸一下，然后放置在火焰上灼烧，待冷却后使用，操作期间还要消毒几次。

3 实验过程

3.1 实验材料的准备

3.1.1 培养基的配制

采用MS(Murashige和Skoog, 1962)培养基。

3.1.2 培养基成分

实验中，七叶树组织培养采用的是MS培养基，培养基的pH值要求在5.8-6.0范围内。

3.1.3 培养基母液装瓶及灭菌

培养基母液配制好后，分别按规定吸取量吸取，加入琼脂、蔗糖混成1∶1溶液煮成培养基，然后进行分装入瓶.入瓶后要立刻用封口膜将容器口处理好，以确保不变干，不被污染。已经封装好的培养基放入高压锅中进行高温灭菌，温度控制在130～135℃之间，保持10min即可。

3.1.4 培养基的保存

经过3天预培养的七叶树培养基，灭菌完毕后，放置于防尘、避光、恒温处。

3.1.5 外植体处理

培养材料的采集,选用当年生嫩枝作为外植体(植物器官)。将采收下来的外植体先置于烧杯中，用流动的自来水冲洗20～60min，再用无菌水漂洗1～3次。把冲洗好的外植体放在磨砂口的玻璃瓶中,倾入70%(浓度)的乙醇没过外植体，并轻晃以除去附着物，经过10～20s将乙醇倒去,用无菌水冲洗。接下来再用配制好一定浓度的氯化汞溶液泡外植体5～10min。将消毒水倒出再注入无菌水，摇动数次后倒出，重复3次。灭菌后，将外植体从瓶中取出放于灭菌过的过滤纸上，把材料上的水吸掉等待接种。

3.2 操作步骤

3.2.1 接种操作

1)接种前器械必须进行消毒，方法是先用水洗净，再用牛皮纸包裹好放入高压锅内进行40～60分钟的灭菌。在进行接种时，先用70%酒精进行表面消毒，再用火灼烧、冷却。超净工作台应先用70%的酒精擦拭一遍，再用紫外灯照射20min。接种工作人员必须穿消过毒的工作服，戴消过毒的口罩，进入工作台前手要用70%酒精进行消毒。

2)接种时左手拿起三角瓶，右手轻轻取下封口膜，动作要慢，以免气流冲入瓶中造成污染。将三角瓶的口靠近酒精灯火焰上燎数下，将灰尘物等固定在原处，然后用镊子将外植体送入瓶中插在培养基上，将镊子放入消毒酒精中，再把封口膜在火焰上旋转灼烧一下，封上口，做好标记，材料接种完毕。

3)接种后3-7天内要每天检查，主要是看有无污染情况发生，细胞观察每隔3-5天看一次并记录结果。

3.2.2 初代培养

经过3-10天的培养，管苗会生出少量不定芽，发现后要做详细记录。同时适量添加一些营养元素，以提高出芽率。

3.2.3 继代培养

经过2-6周左右，可分化出大量的不定芽。当观察到七叶树外植体上的嫩茎长到一定高度时，就可以切割并转接到生根培养基上，进行生根诱导了。

3.2.4 试管苗出瓶

在生根培养基的诱导下嫩茎长出可进行移栽的根系，即可进行出瓶了。在七叶树试管苗出瓶之前，最好进行一些适应性处理，具体包括透气锻炼和脱去基质两个方面：

1)透气锻炼。把试管苗移放到要进行移栽的地方，以便适应外界的变化，随后把瓶口上的封口膜逐次打开，进行通风处理，使其适应生长地空气环境，使植株的成活率生长状况保持稳定。

2)脱去基质。管苗在移前还要把根系上粘着的培养基和水冲净，以免因感染细菌而导致根系发育受到影响，最后就可以将管苗移栽到经过灭菌处理的珍珠岩上或蛭石等基质中。

3.2.5 试管苗移栽

实验证明，用七叶树组培法繁育的幼苗不同于大田苗，必须经历一个炼苗的过渡期，才能适应外界环境，也才能更好地生长。

1)炼苗处理措施:通过控水、减肥、争光、降温等措施。

2)试管苗的炼苗技术：为了提高七叶树组培苗的成活率和保存率，必须采取炼苗措施。具体包括以下三个方面：对于准备移栽的试管苗在培养基中加入矮状素；并在移植前把试管苗放在室内高台处散射光强的地方；使幼苗经过5天的锻炼后再移栽。

4 结论与注意事项

对七叶树苗木进行组织和细胞培养是可行的，小陇山林区可以进行该技术的推广应用。在实验与应用过程中应注意以下事项：

1)对一个树种进行组培快速繁殖，是一个非常精密的系统工程，必须环环相扣。

2)在研究过程中必须严格执行相关技术规定和技术标准要求。

3)应按部就班进行。