MicroRNA在尤文肉瘤中的研究进展

蔡 猛,樊根涛,黄剑浩综述,周光新审校

0 引 言

作为儿童和青少年中第二大常见的骨与软组织肿瘤，尤文肉瘤是一种恶性小圆细胞性肿瘤[1]，常由染色体异位引起，该异位导致FET家族(FUS、EWSR1和TAF15)和ETS转录因子家族成员融合，其中EWSR1-FLI1基因融合是最常见的[2]。目前尤文肉瘤的治疗以手术、化疗和放射治疗为主。尽管随着化疗方案、外科手术和放射疗法的进展，局限性肿瘤患者的5年生存率已提高至65%～75%，但晚期患者和转移患者的5年生存率仍普遍低于30%，预后较差[3-4]。

MicroRNAs(MiRNAs)是一种内源性的非编码小RNA分子，约19～22个核苷酸大小，其广泛存在于动植物以及部分病毒中，通过与特定的基因序列结合来改变蛋白质编码基因在mRNA水平的表达[5]。miRNAs在包括尤文肉瘤在内的多个肿瘤中参与了广泛的生物学过程，如增殖、侵袭、分化和凋亡等[6-7]。miRNAs主要通过改变靶基因在mRNA水平的表达来发挥其作为原癌基因或抑癌基因的作用[8-10]。

1 miRNAs在尤文肉瘤中的差异化表达

已有相关文献报道了在尤文肉瘤组织与正常组织、尤文肉瘤细胞和人骨髓间充质干细胞中差异表达的miRNA。Mosakhani等[11]对尤文肉瘤异种移植和对照组织的微矩阵分析显示，miR-106b、miR-93、miR-181b、miR-101、miR-30b在异种移植组织中高表达，而miR-145、miR-193a-3p、miR-100、miR-22、miR-21、miR-574-3p则低表达。随后Liu等[12]在A673和RD-ES等4个细胞系中证实了miR-21的低表达，而De等[13]对细胞系微阵列分析显示let-7a低表达。Karnuth等[14]检测并比较了40例尤文肉瘤组织、6个细胞系、6例健康人来源骨髓间充质干细胞中miRNAs的表达，19个miRNA显著上调，包括miR-126, miR-146b-5p, miR-501-5p等，16个miRNA显著下调，包括miR-31, miR-137, miR-138等。Li等[15]发现miR-199b-5p在尤文肉瘤细胞系(A673/TC252)中显著低表达。Kawano等[16]对5个尤文肉瘤细胞系和人骨髓间充质干细胞采用miRNA微矩阵分析，let-7a、miR-16、miR-29b、miR-138、miR-301a等在尤文肉瘤细胞系中表达显著下调，而miR-181c显著上调。Parafioriti等[17]通过微矩阵分析比较了20例尤文肉瘤患者石蜡包埋肿瘤组织和正常人人骨髓间充质干细胞，58个mIRNA存在显著差异，其中miR-181b、miR-1915和miR-1275的失调控得到了RT-qPCR的验证。

除了基因表达谱分析，RT-qPCR实验也被广泛的应用于探索尤文肉瘤中差异表达的miRNAs。如miR-107和miR-638，研究表明其在尤文肉瘤细胞系中存在显著的低表达[18-19]。在组织中，Roberto等[20-21]通过RT-qPCR比较19例肿瘤组织和12例正常组织中miRNAs的表达水平，先后发现miR-708-5p，miR-124-3p, miR-139-5p和miR-335-3p在尤文肉瘤中显著低表达。相比于51例尤文肉瘤转移组织，miR-199a-3p在62例局部的未处理原发肿瘤中具有较高的表达水平[22]。在Kawano和Parafioriti等的微矩阵分析结果的基础上，最近的研究进一步证实了miR-146b-5p在ES组织和细胞中显著高表达[23]。这些研究揭示了多个在尤文肉瘤中差异表达的miRNAs，它们往往参与了对肿瘤细胞增殖、调亡、和侵袭等的调控，进而影响尤文肉瘤的发生、发展及预后。

2 miRNAs对尤文肉瘤细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

多个miRNAs在尤文肉瘤中受EWS-FLl-1调控进而发挥促癌或抑癌的生物学功能。如miRs(100, 125b, 22, 221/222, 27a，29a)在尤文肉瘤中的表达受EWS/FLl1抑制，进而负向调节IGF通路，从而发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用[24]。作为一个在尤文肉瘤细胞系中低表达的miRNAs，let-7a同样受EWS-FLl-1直接靶向影响肿瘤的发生发展。通过皮下注射过表达let-7a的尤文肉瘤细胞(A673 和 TC252)，可见小鼠肿瘤重量显著下降，肿瘤的生长被抑制[13]。此外，EWS/FLl1通过抑制miR-708表达来介导EYA3的上调，也可发挥抑制细胞凋亡功能[20]。

除了受EWS-FLl-1的直接靶向而发挥功能调控作用，多个失调控的miRNAs作为促癌基因或抑癌基因参与了尤文肉瘤细胞增殖、凋亡和侵袭的调控。以往的研究证实，通过诱导MiR-34a、miRNA-30a-5p、miR-22的过表达可显著降低ES细胞的增殖能力[25-27]。此外，CCK8试验和凋亡试验显示，在A673、SK-ES-1细胞中转染let-7a类似物来上调let-7a的表达水平可减少细胞的增殖，并加快凋亡进程[28]。而与之相似的是，在A673转染miR-125b类似物，同样可引起细胞增殖的下降和诱导凋亡。且后续的划痕实验和Transwell实验进一步证实，miR-125b的表达上调可抑制细胞的侵袭和转移[29]。在肿瘤细胞系中瞬转miR-31类似物或miR-31前体，TC-71和WE-68细胞数目明显减少，随后通过AnnexinV/PI染色和PI染色分析细胞的凋亡情况，并进行流式分析，结果显示TC-71中miR-31高表达促进细胞凋亡[14]。与HMSCs相比，miR-20b在ES细胞系中相对表达量较高，转染抗miR-20b可抑制ES细胞生长和细胞周期进程[30]。Kawano等[31]基于miRNA微矩阵分析进行研究，发现抗miR-181c可延缓ES细胞的生长和周期进程，促进ES细胞凋亡。而随后的小鼠异种移植模型也证实miR-20b的抑制导致体内ES肿瘤生长的抑制。Guzel等[32]发现在TC71和TC106细胞中转染miR-145可抑制细胞增殖、促进凋亡和抑制侵袭。而过表达miR-193b、miR-30d、miR-34b可抑制ES细胞的增殖和侵袭能力[33-35]。部分miRNAs则作为促癌基因参与尤文肉瘤的生物学进程。研究显示，在ES细胞中转染miR-301a[36]类似物会促进ES细胞的增殖，而转染let-7a、miR-16、miR-29a的siRNA则会抑制SKES1细胞的增殖(16)。总的来说，这些研究证实了miRNAs在尤文肉瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭中发挥重要的调控作用。除上述的miRNAs,考虑可能存在更广泛的miRNAs参与肿瘤细胞增殖和调亡的调控，这尚需后续更多的实验来证实。

3 化疗耐受性

目前，阿霉素、长春新碱、依托泊苷和培美曲塞等药物是临床上化疗的主要用药。Robin等[37]研究显示miR-708表达上升可增强A673细胞对依托泊苷的敏感性。Iida等[38]比较耐受阿霉素的VH-64/ADR细胞和亲代VH-64细胞中差异表达的miRNAs，发现共有46个差异表达的miRNAs，其中miR-125b在耐受阿霉素的VH-64/ADR和WE-68/ADR细胞显著高表达。而通过抗miR-125b下调miR-125b表达可增强EWS细胞(VH-64，WE-68，RD-ES, SK-ES, TC-71)对阿霉素的敏感性。在Sciandra等[39]的研究中，miR-34a稳定过表达可增强A673细胞对阿霉素和长春新碱的敏感性。此外，Qu等[23]发现培美曲塞治疗剂量依赖性地抑制miR-146b-5p的表达进而抑制RD-ES细胞的增殖，这表明培美曲塞在RD-ES细胞中的抗癌作用可通过调节miR-146b-5p的表达来实现。

4 神经分化

此外，部分miRNAs参与了尤文肉瘤细胞神经分化的诱导过程。Ventura等[40]发现miR-34a在沉默CD99的EWS细胞系中显著高表达，且通过转染miR-34a模拟物可显著诱导IOR/CAR细胞的神经分化。随后De等[22]对TC-71细胞来源的沉默CD99的外泌体和表达CD99的外泌体进行微阵列分析，确定了56个差异化表达的miRNA，其中miR-199a-3p显著富集。而转染miR-199a-3p的模拟物同样可诱导TC-71细胞的神经分化。尽管未对其他差异表达的miRNAs进一步研究，但De[22]等认为其中可能存在其他miRNA同样可诱导EWS 细胞的神经分化。这尚需后续的实验进一步的验证。

5 诊断与预后

miR-34a是EWS诊断与预后的一个重要预测指标。Sciandra等[39]对20例原发患者和11例转移患者进行分析，原发患者血浆中miR-34a的表达水样远高于转移患者，且循环miR-34a水平与患者肿瘤大小负相关。ROC曲线分析显示，对患者血浆miR-34a水平的评估或许对于鉴别患者低危和高危是有价值的。而Nakatani等[25]对34例原发EWS患者和21例早期复发EWS患者的预后分析显示，miR-34a和miR-490-3p的表达水平与患者的预后状况是有紧密联系的。无论是EFS还是OS指标，miR-34a高表达都与患者较好的预后相关；而miR-490-3p只与OS相关。而Marino等[41]对109例非转移患者和17例转移患者进行研究，原发肿瘤中miR-34a高表达组患者，有较好的5年无病生存率(74%)、总生存率(83%)。而多因素分析显示，miR-34a低表达是肿瘤预后不良的独立危险因素。

同样的，Kosela-Paterczyk等[44]对8例晚期尤文肉瘤患者和30例健康人的血浆分析进行研究，发现存在42个差异表达的循环miRNA，而ROC曲线和AUC分析结果显示miR-96-5p,miR-4746-5p,miR-424-5p,miR-323a-3等具有诊断价值。

Roberto等[22]的研究中发现，在治疗后出现复发或转移、死亡等肿瘤进展信号的患者中，miR-139-5p和miR-584-5p的表达较低。低表达的miR-139-5p与尤文肉瘤的疾病进程、复发和无病生存期的长短相关。同样的，miR-124-3低表达患者的无病生存期更短。Robin等[37]的研究提示，相比于miR-708高表达患者，低表达患者的3年无复发生存率较差。但在Robert等[21]近期的研究中，miR-708在组织、细胞中低表达，但其与尤文肉瘤患者的预后因素，如转移、复发和生存率等，未见明显的相关性，miR-708对预后的影响尚需进一步研究。

6 结语与展望

综上所述，miRNA在尤文肉瘤中起到了重要的生物学作用，不仅对尤文肉瘤细胞的增殖、侵袭、转移和凋亡发挥功能，还影响着肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。此外，尤文肉瘤对于神经细胞的分化同样也发挥着功能。

尽管局限性肿瘤患者的预后得到了显著地改善，但部分患者，尤其是晚期和转移患者的5年生存率至今仍无显著改善，预后相对较差。近年来随着人们对miRNA在尤文肉瘤中的研究不断深入，我们对其发病机理的分子机制取得了一定的了解，这对我们寻求更有效的治疗方案是极其重要的，但仍需更多的研究去探究miRNA的生物学作用，并寻找miRNA的潜在临床应用。有理由相信，随着人们对miRNA在尤文肉瘤中研究的不断进展，以miRNA作为尤文肉瘤的靶向药物必将成为未来的趋势之一。