与前列腺癌恩杂鲁胺耐药相关铁死亡基因的生物信息学分析

叶大文，张兆存，赵海锋，王硕，姜先洲

山东大学齐鲁医院泌尿外科，济南250012

2020年全球癌症统计中，前列腺癌已成为第三大常见癌症，其病死率约占全球男性癌症相关死亡的7%［1］。目前，内分泌治疗是转移性前列腺癌的标准疗法，但部分患者会在治疗18～24个月后发展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC）。恩杂鲁胺作为第二代雄激素受体抑制剂，已成为许多临床中心治疗CRPC的一线选择。不过，杂鲁胺虽然可以延迟CRPC的进展，但仅可维持患者4～6月的总生存期，这在一定程度上与抗雄治疗后恩杂鲁胺耐药有关，其确切机制尚不清楚［2］。铁死亡作为调节性细胞死亡中的一种，主要特征是铁离子的积累和脂质过氧化物在膜上的聚集［3］。有研究发现，具有固有或获得性耐药的肿瘤细胞对铁死亡高度敏感，且铁死亡与肿瘤免疫治疗的效果密切相关［4］。因此，探索铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌的具体机制，寻找潜在的干预靶点及预后标志基因，对开发有效的CRPC干预措施至关重要。2021年3月—2022年3月，本研究通过生物信息学方法筛选与前列腺癌恩杂鲁胺耐药相关的铁死亡差异表达的基因，并从中进一步寻找具有独立预测价值的预后标志基因，以期能为探索铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌的基础和临床试验提供一定参考和方向。

1 材料与方法

1.1 铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌差异表达基因筛选从GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下载恩杂鲁胺耐药与未耐药的前列腺癌细胞测序基因集GSE104935和GSE78201，以P＜0.05及|log2FC|≥1作为条件筛选差异表达基因。通过FerrDb数据库（http：//www.zhounan.org/ferrdb）收集铁死亡相关基因，包括驱动基因、抑制基因及标记基因。将GSE104935、GSE78201基因集筛选出的差异表达基因及FerrDb数据库收集到的铁死亡相关基因通过ImageGP维恩图工具取交集，得到铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌的差异表达基因。

1.2 铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌差异表达基因的GO功能与KEGG作用通路分析将筛选出的铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌差异表达基因通过R软件的“clusterprofiler”包进行GO功能（包括生物过程、分子功能、细胞成分）和KEGG作用通路富集分析，以校正后P＜0.05作为筛选标准，得到差异表达基因显著富集的功能与作用通路。

1.3 铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌的预后标志基因筛选选取美国癌症研究所及美国人类基因组研究所收集处理的关于前列腺癌的测序数据和临床数据TCGA-PRAD，通过R软件在TCGA-PRAD根据前列腺癌患者的临床预后情况对铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌差异表达基因进行单因素、多因素Cox回归分析，取单因素、多因素Cox回归分析中P均＜0.05的差异表达基因作为铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌的预后标志基因。

1.4 预后标志基因表达及其预后预测价值分析

利用R软件的survival包在TCGA-PRAD队列中分析铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌的预后标志基因的表达水平，以预后标志基因在前列腺癌组织中的表达中位数为界，将患者分为预后标志基因高表达者、预后标志基因低表达者。Kaplan-Meier法比较预后标志基因高、低表达者的总生存期（OS）、无进展生存期（PFI）和疾病特异性生存期（DSS）。利用R软件“survivalROC”包绘制预测患者1、3、5年OS、PFI的受试者工作特征（ROC）曲线，通过曲线下面积（AUC）评价预测效能。

2 结果

2.1 铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌差异表达基因筛选结果GSE104935基因集中共收集到1 278个恩杂鲁胺耐药性前列腺癌差异表达基因，GSE78201基因集中共收集到451个恩杂鲁胺耐药性前列腺癌差异表达基因，FerrDb数据库共收集到259个铁死亡相关基因；使用Image GP维恩图取交集后共获得铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌的差异表达基因31个，分别为LAMP2、VEGFA、ACSF2、EGFR、DNAJB6、ZFP69B、GDF15、TUBE1、ARRDC3、SETD1B、NOX1、SLC38A1、ALOX5、ATG3、MAP1LC3A、GABARAPL1、ATG13、BID、EPAS1、PTGS2、GPX2、SLC1A4、XBP1、RGS4、HSD17B11、GABPB1、AKR1C2、AKR1C3、GCLC、MT1G、ACSL3。见OSID码图1。

2.2 铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌差异表达基因的GO功能与KEGG作用通路分析结果GO功能分析显示，铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌差异表达基因主要富集的生物过程为营养水平反应、细胞对外界刺激的反应、氧化应激反应、细胞对酸性化学物质的反应、酸性化学品反应，主要富集的细胞成分为自噬体膜、次级溶酶体、自噬体，主要富集的分子功能为类固醇脱氢酶活性、醛醇NADP+1-氧化还原酶、酰CoA连接酶活性、NADP+活性、作用于NADPH的氧化还原酶活性；KEGG作用通路分析显示，铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌差异表达基因主要富集的作用通路为花生四烯酸代谢、自噬、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、铁死亡、神经变性疾病。见OSID码图2。

2.3 铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌的预后标志基因筛选结果单因素Cox回归分析显示，LAMP2、NOX1为铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌的预后关键基因（P均＜0.05），见OSID码图3；多因素Cox回归分析显示，VEGFA、LAMP2为铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌的预后关键基因（P均＜0.05）。见OSID码图4。因此，选择LAMP2为铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌的预后标志基因。

2.4 预后标志基因表达及其预后预测价值分析结果TCGA-PRAD队列中LAMP2在前列腺癌组织中相对表达量低于正常组织（P＜0.05）。LAMP2低表达者OS、PFI均低于高表达者（P均＜0.05），DSS与高表达者差异无统计学意义。见OSID码图5。ROC曲线结果显示，LAMP2预测前列腺癌患者1、3、5年OS的AUC分别为0.825、0.747、0.770，预测前列腺癌患者1、3、5年PFI的AUC分别为0.539、0.601、0.568。见OSID码图6。

3 讨论

目前，多西他赛和恩杂鲁胺是前列腺癌的一线治疗手段，但40%～50%的前列腺癌患者对多西他赛的反应没有显示出实质性和持续的前列腺特异抗原下降，中位反应持续时间为6～9个月［5］；而恩杂鲁胺尽管延迟了前列腺癌进展，但仅维持患者4～6个月的总生存期［2］。因此，本研究通过全面的生物信息学分析，识别铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌形成的潜在基因，预测治疗靶点、生物标志物，以期为CRPC治疗提供新的思路和见解。

本研究结果显示，LAMP2为铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌的预后标志基因。LAMP2是溶酶体膜的主要蛋白组分，属于Ⅰ型跨膜蛋白，其中含有生物合成后细胞内靶向所必需的信息。研究发现，LAMP2及其剪接变体LAMP2A、LAMP2B、LAMP2C亚型均显示出组织特异性表达［6］。本研究通过进一步分析发现，相对于PFI，LAMP2预测前列腺癌患者1、3、5年OS具有更高的效率，其AUC分别为0.825、0.747、0.770。由于前列腺癌的肿瘤特性，患者多因非肿瘤原因死亡，因此LAMP2预测前列腺癌疾病特异生存期DSS无统计学和临床意义。

HAHM等［7］研究显示，萝卜硫素可通过激活LAMP2 RNAi和促凋亡蛋白Bax来抑制前列腺癌细胞的死亡。另有研究表明，LAMP2能够降低胞质半胱氨酸的浓度，导致细胞中谷胱甘肽降低、线粒体脂质过氧化，从而使细胞抗氧化能力下降产生氧化应激，通过铁死亡机制诱导细胞死亡［8］。这提示LAMP2能够通过氧化应激介导铁死亡相关机制导致前列腺肿瘤细胞死亡。然而，有关研究发现在前列腺癌不同病理阶段，LAMP2的表达存在一定差异。MORELL等［9］的研究发现，在神经内分泌前列腺肿瘤细胞中LAMP2表达上调，敲低LAMP2后可显著阻断细胞自噬，阻止神经内分泌前列腺肿瘤细胞分化，降低肿瘤细胞存活率，提示LAMP2的高表达能促进前列腺癌神经内分泌分化。上述研究给我们带来了新的思考：是否LAMP2的表达水平可影响前列腺癌由腺癌或低分化癌向神经内分泌转化？但这需要大量的基础研究和临床试验提供更多依据。

铁在内稳态和疾病条件中起到了决定细胞命运的关键作用，细胞内的游离铁具有剧毒，是铁死亡的显著特征。溶酶体作为铁稳态维持的枢纽，整合来自不同亚细胞位点的代谢和细胞死亡信号，已成为控制铁相关代谢途径的信号中枢［10］。铁死亡由脂质过氧化物的过度产生导致的膜完整性受到破坏而引发，改变铁代谢、对氧化应激的反应或脂质过氧化物的产生均可诱导铁死亡［11］，这提示氧化应激与铁死亡调控机制有密切相关性，其均是肿瘤发生和进展的关键步骤［12］。本研究中铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌差异表达基因的GO-KEGG通路富集分析提示其功能多集中在氧化应激反应、自噬体、溶酶体、铁死亡和神经变性疾病方面。LAMP2本身作为溶酶体膜的主要蛋白组分，是含量最丰富的溶酶体膜蛋白，是新陈代谢、生物发生、信号转导和细胞内稳态所必需的蛋白。这提示LAMP2可能是连接溶酶体—氧化应激—铁死亡的关键基因，其可能在前列腺癌发生、进展，恩杂鲁胺耐药形成，甚至神经内分泌转化过程中起到重要作用，但相关功能与机制仍需要大量基础实验研究。

综上所述，本研究基于生物信息学方法筛选铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌差异表达基因，并明确了LAMP2这一关键基因具有独立的预后价值，可作为潜在治疗靶点和预后标志物。然而LAMP2在铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌中分子作用机制和相关信号通路尚不清楚，仍需进一步研究。