基于代谢组学的红细胞贮存损伤相关研究新进展*

王欢 徐方 郭建荣

输血是临床上治疗各种贫血和失血性休克的常规干预措施，但是临床回顾性研究发现，红细胞的贮存时间与输血结局存在潜在负相关性，会降低临床输血治疗效果，甚至可能会导致严重输血不良事件的发生[1，2]。红细胞在体外贮存期间产生了一系列生化和形态学变化，氧化还原代谢的重新编程导致氧化损伤和氧传递受损，并与铁、脂质、糖代谢相耦联，共同导致红细胞完整性和功能受损。

组学技术通过超高通量定量跟踪标记底物的实验研究方法，从整体角度出发分析人类组织器官功能和代谢的状态，更具有特异性和敏感性。代谢组学采用液相色谱-质谱法等技术定量研究了在不同因素刺激下的红细胞生理和病理变化情况，以及基因突变产生的红细胞代谢物的多元动态变化，通过不同代谢物的不同表达水平区别不同的代谢通路[3]，与蛋白组学、转录组学等网络调节通路相关联。全面深入地探究红细胞能量代谢和氧化损伤的生化变化，为更好地理解体外红细胞贮存损伤的相关机制，以及为研发个性化红细胞贮存液提供新视角和新途径，本文通过对现有文献进行回顾，系统概述红细胞贮存期间相关代谢标志物的变化及其意义。

1 红细胞代谢

1.1 氨基酸代谢：蛋白质组学研究发现红细胞在体外贮存中存在：（1）蛋白质碎片化、膜迁移或外化[4]；（2）蛋白质羰基化[5]；（3）细胞溶质和膜蛋白的（非）酶糖基化，以及膜蛋白中的结构蛋白断裂[由蛋白酶或活性氧触发的光谱蛋白、锚蛋白、阴离子交换体1（AE1）和血红蛋白、抗氧化酶和伴侣酶在膜上累积以及转谷氨酰胺酶-2、β-肌动蛋白减少]，这些均与红细胞功能受损相关。羰基化蛋白质在储存的第四周增加，尤其在非去白贮存血中更明显，可作为氧化损伤的一个标志[6]。成熟红细胞缺乏细胞核和细胞器，无法合成新的蛋白质来应对氧化损伤，主要依赖于蛋白质损伤修复机制，如蛋白质异丙烯基部分的甲基化、谷胱甘肽化/氧化硫醇的还原反应等，通过消耗具有抗氧化机制的小分子化合物，如还原的谷胱甘肽（GSH）和蛋氨酸[7]来对抗氧化损伤。

GSH作为细胞内氧化还原缓冲液防止氧化损伤，多数研究认为，没有线粒体的成熟红细胞在体外储存期间，低温和三磷酸腺苷（ATP）不足都限制了GSH的从头合成[4]。谷胱甘肽合成酶减少和代谢产物5-氧代脯氨酸不断累积共同影响了GSH稳态，最终导致GSH随着贮存时间延长而减少[8]，红细胞氧化损伤加剧。还有研究报道，血红蛋白（Hb）氧饱和度和细胞内pH值影响了GSH合成[9]，其浓度的高低可直接影响贮存期间红细胞的结构、功能和输注后血液治疗效果。但有研究者[10]提出，体外贮存红细胞的抗氧化能力降低，主要是因为受到带3蛋白（Band 3）的氧化磷酸化干扰，而不是缺乏GSH。另有研究显示，红细胞GSH浓度是一种遗传特性[11]，谷胱甘肽过氧化物酶（GPXs）参与了调节细胞的氧化应激和细胞膜物质代谢，靶向蛋白组学进一步筛选出GPXs中的关键分子GPX4，是成熟红细胞中的一种高丰度且可遗传的活性酶，能够催化磷脂氢过氧化物还原为相应的磷脂醇，不仅与代谢相关的生物分子（如补体因子和溶血磷脂）关联或反关联，阻止了脂质过氧化，维持膜脂质双分子层稳态，同时也是调控红细胞铁死亡的关键因子，催化脂质过氧化物还原为无毒的脂质醇关键因子。贮存时间的长短与GPX4抗体丰度的差异均影响膜脂质双分子层抗氧化能力及膜稳态，与储存期间红细胞的溶血率相关[12]。

蛋氨酸作为另一种自由基清除剂和甲基供体，也为蛋白质损伤修复途径提供燃料，在氧化天冬酰胺和天冬氨酸残基的循环中至关重要。因此，向红细胞贮存液中补充蛋氨酸可促进蛋白质循环并有助于清除活性氧。另一方面，缺氧储存也可能代表了一种减少红细胞贮存损伤的可行策略，可以防止氧化应激，减少蛋氨酸消耗，最终减少蛋白质甲基化。蛋白质组学方法与13C-蛋氨酸追踪法相结合，推测结构蛋白（锚蛋白，血影蛋白）和功能蛋白质[Band 3、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、醛缩酶A（ALDOA）、双磷酸甘油酯变位酶（BPGM）、乳酸脱氢酶A （LDHA）]均在红细胞对抗氧化应激中起到了关键作用[13]，为后续提高红细胞体外贮存质量的研究提供了潜在的靶点。

1.2 铁代谢：Hb中的二价铁离子作为氧化反应的中心，是研究红细胞氧化应激损伤的关注点之一，过氧化氢（H2O2）与二价铁离子通过Fenton和Haber-Weiss反应生成净羟基，与氧合血红蛋白反应产生高铁血红蛋白，启动过氧化循环。高铁血红蛋白降解产生的高铁血色素原，沉积于细胞膜脂质和骨架上，引起红细胞Band 3聚集，IgG和补体C3增加，激活巨噬细胞识别并清除凋亡的红细胞[14]。二价铁离子还与二磷酸腺苷、组氨酸、乙二胺四乙酸、柠檬酸盐等形成螯合物，破坏红细胞的双层膜结构，产生具有氧化作用的高不饱和脂肪酸，促进活性氧形成，引发脂质过氧化现象，对膜脂和蛋白质造成继发性的氧化损伤[15]。

研究发现，红细胞离体贮存35 d后非转铁蛋白结合铁（NTBI）非线性指数增加，催化了活性氧（ROS）的产生，并促进了嗜铁细菌生长，这也是与脓毒症或菌血症发病相关的因素[16]。对于长期输血的患者，亚铁原卟啉衍生的铁在单核细胞/巨噬细胞中累积，当铁负荷超过铁蛋白储存结合能力时，铁被释放到血浆中，会出现NTBI过量导致的器官损伤，联合应用铁螯合剂和抗氧化剂，可显著抑制亚铁原卟啉细胞毒性作用，有利于铁超载治疗[17]。

1.3 一氧化氮代谢：一氧化氮（NO）作为信号转导分子，通过多种机制参与红细胞在体外贮存状态下的适应调节，NO含量在红细胞体外贮存3 h后开始降低，1 d后下降70%，其后缓慢下降，至21 d已无法检测[18]。

NO代谢与红细胞功能密切相关，红细胞膜上的硝基物质通过内皮型一氧化氮合酶（eNOS）诱导构象改变促进NO释放，在储存期间ATP含量逐渐下降影响了eNOS的活性，直接造成NO生成量减少[19]。最新的研究提出，NO基团可以有效地从亚铁原卟啉转移到半胱氨酸的93位β亚单位（Cysβ93）内，在红细胞内以亚硝基化的半胱氨酸血红蛋白（SNO-Hb）和铁亚硝酰血红蛋白［Hb（FeⅡ）NO］的形式贮存[5]；但又有证据表明，红细胞产生NO的能力与血红蛋白β93半胱氨酸无直接关系，而红细胞的细胞骨架蛋白和膜蛋白可能才是S-亚硝化反应的靶点，其中光谱蛋白可能发生亚硝化反应，参与了NO的代谢[20]，最新研究表明，光谱蛋白的NO-S-亚硝化的半胱氨酸是氧化还原开关，其靶点在血红蛋白、细胞骨架和红细胞膜蛋白共同调控氧化应激反应[21]，潜在的光谱蛋白和其他细胞骨架蛋白被认为是阻止NO进入细胞的物理膜屏障[22]。

另外，NO的生物利用度也是研究中重点关注的问题，红细胞在β亚单位亚铁原卟啉上紧密形成复合物有效地抑制NO生物活性。体外贮存红细胞产生的细胞外血红蛋白（无细胞血红蛋白和含血红蛋白微粒），也会降低NO的生物利用度，这种反应可能是由红细胞的氧化应激反应（四氢生物蝶呤氧化和精氨酸缺乏）所导致[23]。研究者采用具有NO活性的药物可改善红细胞功能，有效减轻输注贮存红细胞导致的不良反应。同样有研究显示，将红细胞暴露于一氧化氮气体，可以有效降低氧化应激下带3蛋白酪氨酸磷酸化，减少高铁血红蛋白与之结合，从而增强红细胞的变形能力[24]。

NO还和糖、氨基酸代谢相耦联，不仅对半胱氨酸硫醇有抗氧化作用，而且还有促进游离的磷酸甘油醛脱氢酶（GAPD）形成，维持GSH的还原作用[25]。

1.4 糖代谢：体外低温贮存的成熟红细胞主要依靠糖代谢供能，持续的糖酵解作用导致细胞内酸化（玻尔效应）从而促进了血红蛋白的氧卸载。pH值不断降低对糖酵解酶的活性产生反馈性抑制，最终导致细胞内高能化合物、ATP和2，3-二磷酸甘油酯（2，3-DPG）的储存依赖性损失[7，26]，葡萄糖的消耗量和乳酸的分泌量是评估储存期间红细胞代谢活性的指标之一[27]。中等碱性的红细胞储存液有利于保持糖酵解限速酶（磷酸果糖激酶）的活性，并通过刺激二磷酸甘油酯变位酶生成2，3-DPG，降低红细胞体外贮存损伤[28]。

研究提示，糖酵解代谢产物聚集在Band3胞质段（CDB3）的细胞质结构域上，可通过糖酵解途径（EMP）和戊糖磷酸途径（HMP）与血红蛋白β链上GAPDH33和C93活性位点上功能残基相互作用来控制葡萄糖通量应对氧化应激[29]。血液在体外贮存期间，选择性的CDB3丢失和微泡的形成，和/或半胱天冬酶3激活导致了Band3水解，与氧合相关的糖酵解酶进行性减少及能量供应的减少相关[28，30]。REISZ等[29]联合采用蛋白质组学与代谢组学方法，发现GAPDH活性位点最初可逆和后来不可逆失活修饰至少存在10种方式。葡萄糖在糖酵解和戊糖磷酸途径中的代谢方式也不同，糖酵解过程中产生的乳酸在储存的前2周内减少，但随后趋于稳定，而戊糖磷酸途径中产生的乳酸比例开始缓慢增加。

红细胞在体外贮存中戊糖激酶活性丧失还可以通过GSH代谢替代途径来进行能量弥补[31]，以及在葡萄糖完成HMP途经的氧化阶段后，进入嘌呤补救合成途径（PSP）。腺嘌呤在贮存前10～14 d内迅速消耗，从上清液不断渗透到胞浆，磷酸化产物ATP、二磷酸腺苷（ADP）、一磷酸腺苷（AMP）和腺苷逐渐下降。体外贮存2周后不再替代供能，乳酸水平不断增高；贮存后期，腺嘌呤耗竭后，腺苷三磷酸代谢产物次黄嘌呤（HX）和黄嘌呤显著增加，次黄嘌呤激活了黄嘌呤氧化酶，并随后产生过氧化氢[32]，借此可以通过监测HX以及黄嘌呤的量来评估贮存红细胞质量。

1.5 脂质氧化代谢：红细胞膜脂来源于循环中的脂肪酸，其组成与血浆中的脂肪酰密切相关。红细胞膜脂受到饮食影响[33]，细胞内钙离子、高能磷酸盐化合物含量、红细胞膜脂构成的不饱和程度均与红细胞在贮存过程中糖酵解减少、氧化应激增加导致的红细胞贮存损伤明显相关[34]。磷脂酶促进膜脂中脂肪酰基部分释放，过氧化物酶6迁移到膜上并发挥磷脂酶A2样活性[35]，启动脂质过氧化循环，导致红细胞的代谢重组，产生具有生物活性的氧化不饱和脂肪酸。据报道，体外低温贮存血液中的花生四烯酸（AA）、游离的高度不饱和脂肪酸（HUFA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳五烯酸（DPA）这些脂肪酸不断增加，并且膜脂中游离HUFA不饱和程度与红细胞的溶血率和血液治疗的效果密切相关[36]。AA作为亚油酸的代谢产物诱导氧化应激反应，刺激活性氧的产生，导致细胞膜破裂，释放亚铁原卟啉及二价铁离子，同时游离脂肪酸（FFA）还可诱导中性粒细胞释放超氧基，激活受体交互作用蛋白1（RIP1），同时抑制线粒体呼吸链中的复合酶Ⅰ和Ⅲ的活性，诱导生成大量的ROS攻击红细胞膜脂质，导致共轭二烯、丙二醛（MDA）及其他短链的醛、酸随着贮存时间的延长而逐渐增加，直接破坏质膜的磷脂双分子层结构和膜骨架蛋白，降低细胞膜流动性，脆性增加，溶血率增加，其中MDA是细胞膜中的脂类物质与活性氧发生过氧化反应所产生的重要产物之一，也可作为细胞及组织氧化应激反应损伤程度的重要指标[11]。

红细胞体外贮存的第10 d、第23 d、第42 d采用定量质谱分析发现，游离脂肪酸的量和去饱和程度随着贮存时间延长而增加，多不饱和脂肪酸（PUFA）在贮存的后期增加更为明显[1]，与储存溶血率及输血后恢复情况相关[37]。有证据表明，脂肪酸去饱和酶（FADS）在糖酵解中将NADH循环转化为NAD，是保持氧化应激时正常膜流动性的代偿机制[1]，溶血脂质和单酰基甘油也随着储存时间延长而增加，在脂质氧化前游离脂肪酸就从甘油磷脂中分解释放出来，并且两者存在明显的相关性，对预测红细胞贮存损害具有参考价值[36]。

2 代谢组学和蛋白质组学技术在红细胞贮存损伤研究中的应用 代谢组学与蛋白质组学技术是通过生物信息学方法和数学建模系统来量化代谢物、蛋白质和脂质分子，可更好地理解红细胞贮存损伤标志物，为后续制定标准化指标评估红细胞产品的质量，改善红细胞储存条件，以及确定输注后治疗效果提供了依据[38]。虽然临床相关性仍然有争议，但是随着技术的不断完善和交互组学的进一步深入研究，代谢组学和蛋白质组学技术能更加全面地理解对于胚胎期、出生后至青春期、成年后等不同时期红细胞生成机制，而非只针对特定的分子或通路，以此有望开发和优化当前输血策略替代方案，例如：基于蛋白质组学的血红蛋白氧载体或膜/脂质体包被人工血红蛋白，造血干细胞和输血用培养血液制品的体外培养和扩增策略的发展，这些都可能在将来应用于临床，对于调节红细胞功能、血液黏度、血流状态，从而影响组织灌注具有潜在的重要意义[21]。

代谢损伤与体外贮存时间存在明显的正相关，然而其损伤程度与能量的代谢也密不可分。代谢组学分析发现了糖酵解、嘌呤、谷胱甘肽、羧酸盐和硫代谢这些途径与储存年龄和供体变异性相关，供体生物学特性（性别、年龄、种族、生活习惯，如尼古丁、酒精、咖啡因或牛磺酸等）导致红细胞在贮存前就已存在差异[37]，不同贮存液，如SAGM、AS1、AS3、AS5和PAGSM均存在代谢异质性，导致不同程度的能量代谢损伤变化[39-41]。针对特殊情况优化输注策略，如输注体外贮存时间较长的血液、献血者存在家族性假性高钾血症、受血者为儿科患者时，均需要再次清洗上清液后再行输注[5]。代谢组学研究提示，在现有的贮存添加剂保存下，红细胞受损时ATP和2，3-DPG下降，通过添加低氯化物或无氯化物、重碳酸盐类等策略，促进贮存红细胞碱化，从而有利于糖酵解和能量代谢[41]；添加磷酸腺嘌呤葡萄糖鸟苷葡萄糖酸甘露醇（PAG3M），可以有效地防止2，3-DPG的消耗，血液的整体贮存质量得到提升[6]；厌氧储存或补充抗氧化剂来限制促氧化剂、氧自由基生成反应，清除二氧化碳，从而促进细胞内碱化和能量代谢[15]；添加脂质过氧化抑制剂姜黄素，通过其有效清除脂质过氧自由基而减少氧化损伤，同时增加细胞内GSH量来调节抗氧化酶活性，降低渗透脆性和降低溶血率[42]。

3 总结与展望 血液的“分子年龄”与“储存年龄”不同，将捐献者的遗传多态性、贮存红细胞的代谢变化、血液治疗效果三者联合分析，才能更为准确地解释“储存单位的代谢年龄”，通过组学技术发展和高通量代谢组学策略的引入[43]，关注以前未被重视但对缺氧适应性反应有意义的相关代谢通路，如柠檬酸盐通路、损伤修复通路、嘌呤/鞘脂轴等[44-45]，进一步研究如何保证低温贮存红细胞中FADS活性和降低脂质氧化等问题[15]，可以为新型储存策略和解决方案提供新的方向。在可预见的未来，红细胞研究将通过解决对于代谢连锁表型的改变来推进输血医学和血液学的发展，其中包括但不限于储存添加剂、酶病（例如葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺乏、缺氧、败血症或出血）等。同样我们还可以针对特殊的受血者（例如创伤患者[46]和镰状细胞受血者[47]，糖尿病、婴幼儿患者等），记录详细的输血前后个体化表征，更加深入地研究将有助于为新型的个性化血液制品，为贮存液的开发铺平道路，形成个性化血液治疗方案，这都是未来不断提高输血治疗效果的关键。

另外，随着组学技术的不断发展，可以研发出当前输血策略的替代方案，基于血红蛋白的氧载体（HBOC）可能提供治疗性氧合[48]，脂质体包裹的肌动蛋白-血红蛋白（LEAcHb）分散体通过将肌动蛋白基质引入脂质体水溶液中作为潜在的血液替代品[49]；蛋白质组学和代谢组学的发展促使我们更加深入地了解红细胞的生成机制，非血液来源的细胞[如诱导多能干细胞（iPSC）和胚胎干细胞（ESC）]可通过转录因子异位表达对人体体细胞进行重新编程，生成与人类白细胞抗原（HLA）匹配的造血干细胞（HSC），为疾病建模和再生医学提供新途径[50-51]，这些都将是未来研究的方向和不断提高输血治疗的关键。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突