膨腹海马人工繁殖与育苗关键技术

2022-11-24何丽斌祁剑飞林金波陈欣欣罗辉玉郑乐云

应用海洋学学报 2022年4期

何丽斌,祁剑飞，林金波,陈欣欣,罗辉玉，王庆,郑乐云*

(1.福建省水产研究所，福建厦门361013；2.厦门小嶝水产科技有限公司，福建厦门361103；3.华南农业大学海洋学院，广东广州510642)

海马作为一种重要的中药材，在我国有“南方人参”的称号。近年来海洋生态环境的变化、近海污染的加剧和人类的过度捕捞对海马的摄食、栖息环境及海马种群的繁衍均造成了严重的破坏[1]，目前海马的野生种群已经濒危[2]。世界生物保护组织已把所有已知的海马种类都列入濒危野生动植物种国际贸易公约附录Ⅱ[3]，人工增养殖已成为满足市场需求,保护海马资源的唯一选择[4]。膨腹海马(Hippocampusabdominalis)，又称大腹海马，是所有已知海马种类中最大的一种，主要分布于西南太平洋区的澳大利亚及新西兰海域，栖息在礁石区，随着海草游动，属肉食性，以小型甲壳类为食。随着科学技术的发展，越来越多的检测方法被应用到科学研究中，海马的一些药用功效得到了证实[5-8]。2016年，福建省水产研究所海马研发项目组联合厦门小嶝水产科技有限公司引进澳大利亚膨腹海马，当年苗种繁育成功。几年来，项目组开展了膨腹海马生殖生理学、养殖生态学及基因组学等多方面的研究，2020年，突破了膨腹海马规模化人工育苗及病害防控关键技术，培育全长4.0～6.0 cm膨腹海马苗种18.5万尾；2021年1—6月，项目组培育平均全长8.9 cm的膨腹海马苗种133万尾，该品种现已在福建省及山东省日照、烟台等地推广养殖，并取得良好的效果，促进了海马人工养殖在我国的产业化发展进程。

目前国外海马养殖规模较小，价格较高，主要用于观赏用途[9]。国内人工繁养海马的研究主要集中在海马的生活习性及生长形态学等方面[10-11],研究对象主要有美国线纹海马(即直立海马，Hippocampuserectus)、三斑海马(Hippocampustrimaculatus)、大海马(Hippocampukuda)等，有关膨腹海马人工繁殖及苗种培育技术方面的研究尚未见报道。本研究以膨腹海马为研究对象，探讨温度、亲鱼配对方式及苗种培育密度对其亲本生殖及苗种生长存活的影响，为膨腹海马的苗种繁育和生物学研究提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

温度对膨腹海马亲鱼生长、存活及生殖影响实验中，实验海马为项目组培育的170日龄的亲鱼，雌鱼体长10.48～12.42 cm、体质量3.06～5.99 g，雄鱼体长10.18～11.20 cm、体质量3.38～5.17 g，雌雄鱼均已性成熟；亲鱼放养于容量0.5 t的塑料水槽。

配对方式及亲鱼数量对膨腹海马生殖影响的实验中，实验海马为项目组培育的250日龄且已繁殖2个多月的成熟亲鱼，亲鱼体长12.10～15.82 cm，平均体长13.90 cm，体质量4.53～7.46 g，平均体质量5.95 g；亲鱼放养于容积为300 L的塑料水槽。

培育密度对膨腹海马苗种生长、存活影响的实验中，实验海马幼苗为项目组繁育的1日龄膨腹海马幼鱼，鱼苗全长(2.10±0.34)cm，体质量(0.010±0.002)g；苗种放养于容积100 L白色塑料水槽。

1.2 实验方法与养殖管理

1.2.1 温度对膨腹海马亲鱼生长、存活及生殖的影响 ① 实验组设置。实验设13.0、16.0、19.0、22.0 ℃共4个不同温度实验组，水温波动范围±0.5 ℃，每组设3个平行组，每个平行组随机抽取20尾雌鱼及20尾雄鱼(20对)放养于0.5 t的塑料水槽中；自然水温低于实验所需水温时用电热棒加温，自然水温高于实验水温时用制冷机降温。②日常管理。亲鱼饵料以冰冻糠虾为主，配合少量的活体桡足类。每天上、下午各投喂一次糠虾，以略微过量为度，投饵1 h左右通过吸底清理残饵；每天下午糠虾投喂好后每个水槽均补充适量活体桡足类。亲鱼流水培育，实验用海水是经两次沙滤的自然海水，盐度30～33，pH 8.0～8.1，日换水量约100 %；实验周期120 d。③ 数据统计。每日分别捞取并统计每个实验水槽海马亲鱼产苗数量，由于实验开始前，部分雄鱼可能已受孕，为排除实验前受孕对实验的影响，本实验产苗量从开始实验一个月后正式统计；每日记录每个实验组亲鱼死亡数量，雌、雄鱼分别记录；每30 d分别测量每组亲鱼雌、雄鱼的体长、体质量；产苗量的多少以每尾雄鱼日均产苗量作为比较依据。

1.2.2 配对方式及亲鱼数量对膨腹海马生殖的影响 ①实验组设置。实验设雌雄数量比为1∶1、3∶2、2∶1、2∶3、1∶2等5种配对方式，每种配对方式亲鱼的数量多少不一，其中1∶1配对方式设1♀+1♂、2♀+2♂、4♀+4♂、6♀+6♂、8♀+8♂、10♀+10♂等6个实验组；3∶2配对方式设3♀+2♂、6♀+4♂、9♀+6♂、12♀+8♂、15♀+10♂等5个实验组；2∶1配对方式设2♀+1♂、4♀+2♂、8♀+4♂、12♀+6♂、16♀+8♂、20♀+10♂等6个实验组；2∶3配对方式设2♀+3♂、4♀+6♂、6♀+9♂、8♀+12♂、10♀+15♂等5个实验组；1∶2配对方式设1♀+2♂、2♀+4♂、4♀+8♂、6♀+12♂、8♀+16♂、10♀+20♂等6个实验组，每个实验组均设3个平行。实验鱼按实验设计的比例及数量随机分养于实验水槽。②日常管理。亲鱼砂滤自然海水流水培育，实验期间自然水温13.0～20.2 ℃，盐度30～32，日换水量约100 %。亲鱼饵料以冰冻糠虾为主，配合少量的活体桡足类。每天上、下午各投喂一次糠虾，以略微过量为度，投饵1 h左右通过吸底清理残饵；每天下午糠虾投喂好后每个水槽均补充适量活体桡足类；实验周期120 d。③数据统计。每日分别捞取每个实验水槽初生的海马苗，并统计数量，由于实验开始时，部分雄鱼可能已受孕，为排除实验前受孕对实验的影响，本实验产苗量从开始实验一个月后正式统计；产苗量的多少以每尾雄鱼日均产苗量作为比较依据。

1.2.3 培育密度对膨腹海马苗种生长、存活的影响 ①实验分组。实验设0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 尾/L共7个不同密度组，每组设3个平行，1日龄的实验膨腹海马幼苗按数量随机放养于各实验水槽。②日常管理。苗种砂滤自然海水微流水培育，实验期间自然水温17.2±7.2 ℃，日换水量50 %～100 %；每日吸污并检查和登记死亡数量；实验周期60 d。③生长指标和统计学分析。第30天和第60天每个平行随机抽取20尾海马，测量全长和体质量指标，并清点鱼苗数量，计算成活率。

1.3 数据计算与分析

采用Excel 2010和SPSS 20.0统计学软件对数据进行统计分析。对海马体长、体质量、成活率、雄鱼日均产苗量等用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，Duncan氏法进行多重比较，P<0.05为差异显著。

成活率、日体长增长率、日体质量增长率、日均产苗量的计算方法：

S=(NT/N0)×100

(1)

LGR=[(LT-L0)/L0]/t×100

(2)

WGR=[(WT-W0)/W0]/t×100

(3)

NAVG=(NSEED/NMALE)/t

(4)

式(1)至(4)中：S为成活率(%)；NT为终末鱼数量(尾)；N0为初始鱼数量(尾)；LGR为日体长平均增长率(%)；LT为终末平均体长(mm)；L0为初始平均体长(mm)；WGR为日体质量平均增长率(%)；WT为终末平均体质量(g)；W0为初始平均体质量(g)；NAVG为日均产苗量(尾/d)；NSEED为总产苗量(尾)；NMALE为雄鱼数量(尾)；t为养殖实验时间(d)。

2 结果与讨论

2.1 温度对膨腹海马亲鱼生长、存活及生殖的影响

不同温度对膨腹海马存活、生长及繁殖力的影响见表1。从表1可知，在120 d的实验期间，13.0、16.0、19.0 ℃组雌鱼平均成活率分别为95.0 %、100.0 %及95.0 %，无显著差异(P>0.05)，但22.0 ℃组雌鱼的平均成活率仅为50.0 %，低于其他3个实验组，差异显著(P<0.05)。雄鱼成活率情况与雌鱼类似，13.0、16.0、19.0 ℃组成活率为93.3 %～100.0 %，3组间无显著差异，22.0 ℃组雄成活率为32.5 %，明显低于其他3组，差异显著。亲鱼体长日增长率大小依次为16.0、19.0、13.0、22.0 ℃组，16.0 ℃组日增长率高于其他3组，且差异显著；19.0、13.0 ℃组高于22.0 ℃组，且差异显著，但二者间无显著差异；22 ℃组低于其他3组且差异显著。亲鱼日增重率大小顺序依次为16.0、19.0、13.0、22.0 ℃组，4组间的差异情况与体长增长率相似。4个实验组雄鱼日均产苗量大小依次为16.0、19.0、13.0、22.0 ℃组。16.0 ℃组日均产苗量最大，为1.75尾/d，与19.0 ℃组的1.52尾/d无显著差异，但与13.0 ℃组及22.0 ℃组差异显著；13.0 ℃组与19.0 ℃差异不显著；22.0 ℃组日均产苗量为最低，为0.07尾/d，低于其他组且差异显著。实验结果显示，膨腹海马亲鱼生长速度、成活率及产苗量在16.0、19.0 ℃两组相对较高，这是由于16.0～19.0 ℃是其适宜的生长温度，此时亲鱼的新陈代谢、生长发育速度加快，有利于亲鱼的生长和成活。当温度上升到22.0 ℃时，膨腹海马亲鱼生长速度、成活率及产苗量均大幅下降，这是由于22.0 ℃超出了亲鱼的适宜生长温度从而导致其生长速度下降，发育迟缓，死亡率增加等现象。鱼类生长与温度的关系可以波形曲线表示:曲线的顶点即为鱼类的最适生长温度，温度升高或降低都会影响其生长速率和成活率[12]，鱼类在适宜的温度范围内，外界对其胁迫小,鱼体消耗小部分能量抵御外界不良环境,剩下较多能量用于生长,同时对营养物质吸收率较高,反之，用于生长能量比重降低,鱼体生长相对缓慢[13]。大海马[14]、线纹海马[15]在26.0 ℃时生长率最高、产苗量最大，而膨腹海马温度升高至22.0 ℃时其生长速度、成活率及产苗量均大幅下降，但当温度降低至13.0 ℃时，膨腹海马亲鱼生长速度和产苗量虽大幅下降，成活率却高达95.8 %，这与膨腹海马是冷水性鱼类，对高温的耐受性较差有关，与冷水性鱼类大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[16]最适生长温度14～18.0 ℃相似。

表1 温度对膨腹海马亲鱼生长、存活及产苗量的影响Tab.1 Effects of temperatures on growth,survival and seedling yield of Hippocampus abdominalis

2.2 配对方式及亲鱼数量对膨腹海马生殖的影响

2.2.1 相同配对方式下亲鱼数量对膨腹海马产苗量的影响相同配对方式，膨腹海马亲鱼群体数量不同对其产苗量的影响情况见表2。雌雄比为1∶1时，雄鱼日均产苗量为1.96～2.83尾/d，1♀+1♂实验组产苗量最小，但与其他各组间无显著差异(P>0.05)。雌雄比为3∶2时，雄鱼日均产苗量为1.28～2.33尾/d，3♀+2♂实验组产苗量最小，但与其他各组间无显著差异。雌雄比为2∶3时，雄鱼日均产苗量为1.81～3.05尾/d，2♀+3♂实验组产苗量最小，但与其他各组间无显著差异。雌雄比为2∶1时，雄鱼日均产苗量为0.47～2.33尾/d，2♀+1♂实验组产苗量最小，与其他各组间差异显著(P<0.05)，但其他各组间差异不显著。雌雄比为1∶2时，雄鱼日均产苗量为0.95～2.43尾/d，其中2♀+4♂实验组产苗量最小，除了与6♀+12♂实验组无显著差异外，与其他各组间差异显著；6♀+12♂实验组日均产苗量为1.31尾，显著低于4♀+8♂组、8♀+16♂组及10♀+20♂组且与1♀+2♂组及2♀+4♂组无显著差异；10♀+20♂组产苗量最高，除与4♀+8♂组差异不显著外，均显著高于其他各组；4♀+8♂组与8♀+16♂组产苗量均较高，二者间无显著差异，但均显著高于1♀+2♂、2♀+4♂及6♀+12♂组。5种配对方式中，雌雄比为1∶1、3∶2及2∶3的实验组，亲鱼数量较少的其雄鱼日均产苗量较少，亲鱼数量较多的雄鱼日均产卵量相对较多，差异不显著；雌雄比为2∶1及1∶2的实验组，亲鱼数量少的实验组日均产苗量也相对较少，差异显著。实验结果表明雌雄比例的比值大于1.5，将影响亲鱼种群的生殖行为，日均产苗量相对较少。

表2 相同配对方式下不同亲鱼数量对膨腹海马产苗量的影响Tab.2 Effects of different parent fish numbers on seedling yield of Hippocampus abdominalis under the same pairing mode

2.2.2 不同配对方式对膨腹海马亲鱼产苗量的影响 1♀∶1♂、3♀∶2♂、2♀∶1♂、2♀∶3♂、1♀∶2♂等5种配对方式雄鱼日均产苗量统计结果见表3。雄鱼日均产苗量为1.72～2.41尾/d，由大到小顺序依次为2♀∶3♂组、1♀∶1♂组、3♀∶2♂组、2♀∶1♂组及1♀∶2♂，其中2♀∶3♂、1♀∶1♂、3♀∶2♂、2♀∶1♂ 4组间无显著差异(P>0.05)，2♀∶3♂、1♀∶1♂二组产苗量显著高于1♀∶2♂组(P<0.05)，3♀∶2♂、2♀∶1♂组与1♀∶2♂组间差异不显著。

表3 不同配对方式膨腹海马产苗量的差别Tab.3 Difference in seedling yields of Hippocampus abdominalis in different pairing methods

海马属中绝大多数种类的性角色关系为雄鱼竞争配偶权[17-18]，只有膨腹海马会表现出性角色逆转的现象[19]。目前关于膨腹海马交配过程中的配对方式及亲鱼数量的报道还很少，今后有待进一步研究以提高产苗量。

2.3 培育密度对膨腹海马苗种生长及成活的影响

不同培育密度下，第30天膨腹海马苗种各生长指标及成活率见表4。通过生长指标的分析发现，密度低的实验组其生长速度相对较快。第30天，0.25、0.50尾/L实验组海马苗种平均体质量高于其他实验组，差异显著(P<0.05)，但二者间无显著差异(P>0.05)；1.00尾/L实验组显著高于2.00、3.00、4.00、5.00尾/L各组，差异极显著；2.00尾/L实验组显著高于3.00、4.00、5.00尾/L各组，差异显著；3.00、4.00、5.00尾/L各组间无显著差异；第30天各组间平均全长的差异情况与各组间平均体质量的差异情况类似。第60天，0.25、0.50、1.00尾/L实验组海马苗种平均体质量均高于2.00～5.00尾/L其他各组，且差异显著；3组间体质量0.25尾/L组>0.50尾/L组>1.00尾/L组，且差异显著。2.00、3.00、4.00、5.00尾/L各组体质量均较小，但各组间无显著差异。第60天各组间平均全长的差异情况与各组间平均体质量的差异情况类似。

第30天，各密度组成活率在92 %～95 %之间，无显著差异(P>0.05)；至第60天,各密度组成活率在73 %～84 %之间，无显著差异，各组间成活率高低与培育密度无规律性的关系。

养殖密度作为水产动物生长的重要环境胁迫因子[20]对养殖动物的生长速度及成活率均有直接影响[21-22]，“合理的养殖密度”是提高养殖效率的重要条件之一。过低的养殖密度会使个体之间行为的相互作用减少[23]，在一定程度上抑制鱼类的生长率、成活率[24-25]从而影响其个体的生长发育；但过高养殖密度会导致鱼类对养殖水域空间、食物资源的竞争渐趋激烈，引起鱼类应激反应，增大疾病发生可能性，从而使养殖群体的生长率、成活率下降[24,26-27]。本研究结果显示：第60天，0.25～5.00 尾/L的培育密度，膨腹海马苗种成活率没有显著的差异，相对较低的密度，海马苗种依然能有较高的存活率，这与胡培培等(2014)[28]研究表明低密度放养的鳡幼鱼有较高的死亡率且生长缓慢的结果不一致，这可能是低密度的鳡幼鱼由于聚集困难从而导致对外界刺激不敏感、摄食不积极最终造成较高死亡率，而膨腹海马在相对较低密度下，依然可以积极摄食从而保持较高存活率。培育密度对60日龄前膨腹海马苗种的生长速度具有显著性的影响，不同密度同期苗种体质量最大差异在3倍以上，早期阶段(1～30日龄前)，培育密度3.00～0.50 尾/L范围内，密度越低生长速度越快，但当密度等于和低于0.50尾/L时(即密度0.50尾/L与0.25 尾/L)，密度对生长速度没有显著影响；培育密度3.00～5.00 尾/L范围内，苗种生长速度均较慢，但没有显著差异。中期阶段(30～60日龄)，培育密度2.00～0.25 尾/L范围内，密度越低生长速度越快，培育密度2.00 尾/L～5.00 尾/L范围内，苗种生长速度均较慢，但没有显著差异，这与一定范围内放养密度的增减对鱼类的生长没有影响相符[29-30]。