怀牛膝的化学成分和分析方法研究进展

李存红 符德学 侯 艳

（1.焦作市怀药活性成分分析利用工程技术研究中心，河南 焦作 454000；2.焦作大学化工与环境工程学院，河南 焦作 454000）

牛膝为觅科植物牛膝的干燥根,又名百倍、怀牛膝、牛茎等，被《中华人民共和国药典》(2015版)收载为常用中药，具有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨、利尿通淋、引血下行之功效[1]。河南焦作的武陟、温县、沁阳种植的牛膝称为怀牛膝，是闻名中外的“四大怀药”之一。怀牛膝的化学成分主要包括皂苷、甾酮、黄酮、糖、生物碱等，为了进一步开发和利用怀牛膝资源，本文对怀牛膝主要化学成分研究概况和怀牛膝中活性成分的分离分析方法进行了综述。

1.怀牛膝的化学成分

1.1 牛膝多糖

药理研究表明，牛膝多糖具有显著的增强人体免疫功能的作用，能升高血清溶血素和脾脏内抗体形成细胞数，激活网状内皮系统的吞噬功能，促进淋巴细胞增殖，增强NK细胞和CTL细胞的活性。它还有增强人体骨髓造血功能、明显抑制肿瘤生长的作用，无毒性。

方积年[2]等人从牛膝中提取到具有免疫活性的肽多糖。Yu Biao[3]等从牛膝中得到一种具有增强机体免疫系统活性的多糖类成分。惠永正[4]等从牛膝中分离得到一种具有免疫功能的水溶性寡糖。

1.2 牛膝皂苷

牛膝皂苷是怀牛膝的主要化学成分，牛膝皂苷主要是以齐墩果酸为苷元的三萜皂苷，该类成分一经水解，就会生成葡萄糖醛酸、齐墩果酸等。牛膝皂苷有保肝降酶、抗肿瘤、降血脂等作用，能明显降低血清中甘油三酯、胆固醇和脂蛋白的含量。

李娟等[5]研究了怀牛膝根中三萜皂苷类成分，将怀牛膝用乙醇提取，过滤，减压浓缩得稀浸膏。将稀浸膏用水稀释，用乙酸乙酯、正丁醇萃取，液相色谱分离鉴定，得到了齐墩果酸、竹节参皂苷-1,齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷、齐墩果酸-3-Oβ-D-(6’ -丁酯)-吡喃葡萄糖醛酸苷、齐墩果酸-3-O-β-D-(6’-甲酯)-吡喃葡萄糖醛酸苷、3-O-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-齐墩果酸-28-O-(β-D-吡喃葡萄糖)等三萜皂苷类化合物。

罗懿钒[6]等己整理出从牛膝中分离到的39种三萜皂苷类化合物。

1.3 甾酮类成分

甾酮类化合物也是怀牛膝的主要活性成分，怀牛膝中的甾酮类化合物主要有牛膝甾酮和蜕皮甾酮两种。牛膝甾酮具有促进蛋白质的合成、抑制由于药物引起的血糖升高、降胆固醇和使受损的细胞再生的作用。

杨柳等[7]将干燥的牛膝以水煎煮提取，得水溶液提取物。水溶液提取物经D101型大孔吸附树脂柱色谱，用水、乙醇依次洗脱，洗脱组分经液相色谱法分离鉴定，得到25，26-二去氢坡那甾酮A、红苋甾酮。

王秋红[8]等将干燥的牛膝用水反复煎煮，过滤，减压蒸馏回收，得水溶液提取物。水溶液提取物经D101型大孔吸附树脂柱色谱、硅胶柱色谱、ODS反相柱色谱及制备型高压液相色谱，从中分离得到了β-蜕皮甾酮、25S-牛膝甾酮、25R-牛膝甾酮、旌节花甾酮C、旌节花甾酮D等甾酮类化合物。

孟大利[9]用大孔树脂、硅胶柱、氧化铝柱、SePhadexLH-20，从牛膝中分离出牛膝甾酮A、25-R牛膝甾酮、25-S牛膝甾酮、漏芦甾酮B、族节花甾酮D、β-蜕皮甾酮、水龙骨甾酮B、红览甾酮。

罗懿钒[6]等己整理出从牛膝中分离到的31 个甾酮类化合物。

1.4 生物碱类

巢志茂[10]等从怀牛膝炮制品中分离出甜菜碱并测定其含量，G.Bisht等[11]从牛膝中分离得到了生物碱类化合物。

孟大利[9]利用大孔树脂、硅胶柱、氧化铝柱、SePhadexLH-20、制备薄层以及制备型高压液相色谱等色谱手段，从牛膝乙醇提取物中分离出4种生物碱，经鉴定为小檗碱、巴马亭、黄连碱、表小檗碱。

1.5 黄酮类

孟大利[9]从牛膝中分离出汉黄芩素、黄芩苷、芦丁、槲皮素、山萘酚等。冬海洋等[12]从牛膝叶中得到了异槲皮素。

1.6 其他成分

冬海洋等[12]对怀牛膝叶的化学成分分析测定，共检测到38 种化合物，其中亚油酸、牛膝甾酮A、棕榈酸、异槲皮素、N-顺式阿魏酰基酪胺、姜状三七苷R 1、旌节花甾酮这7种化合物相对含量达5%以上。

巢志茂等[13]以气相色谱和质谱联用，分析和鉴定了怀牛膝干燥根挥发油的化学成分:二十四烷等11个长链烷烃、3-壬烯-2-酮等8个酮类、十六酸等6个长链饱和脂肪酸、乙醛等6个醛类、己醇等6个醇类、邻苯二甲酸二丁酯等5个酯类化合物，并指出，2，6-二甲基吡嗪、2-甲氧基-3-异丙基吡嗪和2-甲氧基-3-异丁基吡嗪可作为怀牛膝挥发油的特征性成分。

2.怀牛膝中化学成分分离方法

牛膝中生物活性成分的提取分离方法有多种，各有特点，主要有：回流提取法、超声波提取法、加速溶剂萃取法、超临界流体萃取法等。

回流提取法一般用乙醇、甲醇或水作溶剂进行提取，然后回收溶剂。此方法简便易行,能够比较彻底地提取出牛膝中的生物活性成分；超声提取法用超声波强化提取牛膝中的生物活性成分，超声波能破坏植物药材的细胞,使溶媒渗透到牛膝细胞中,加速牛膝中的有效成分溶解,从而提高活性成分的提取率。

加速溶剂萃取法是Richter于1995年提出的一种萃取方法，可用于从固体牛膝药材中提取生物活性成分。其原理是在密闭容器内，在高温、高压条件下，用溶剂对牛膝样品中的生物活性成分进行提取。升高压力可提高溶剂的沸点,从而提高有效成分在提取溶剂中的溶解度；升高温度可以降低液体黏度，减少流动阻力，有利于溶剂分子向牛膝样品基质扩散，缩短牛膝活性成分进入溶剂的时间。溶剂萃取法的优点主要是：缩短提取时间,提高提取效率，减少溶剂用量。

超临界流体萃取是用超临界流体作为溶剂来提取牛膝中的活性成分。物质气态时加压液化允许的最高温度称为该物质的临界温度，临界温度时液化所需的最小压力是该物质的临界压力。温度和压力处于临界温度和临界压力之上的流体称为超临界流体。超临界流体既具有液体的性质，也具有气体的性质，超临界流体具有以下特点：⑴密度与液体相当；⑵黏度接近气体,流动阻力很小；⑶扩散系数介于气液之间，物质在里面的传递速率很快。超临界流体萃取法提取牛膝中活性成分时，其提取过程一般分为四个阶段：⑴牛膝活性成分从牛膝样品基质中解析；⑵活性成分在牛膝样品基质中扩散；⑶牛膝活性成分扩散到超临界流体中；⑷牛膝活性成分通过超临界流体从萃取室中流出。影响超临界流体萃取的主要因素有超临界流体的选择、萃取压力、萃取温度、萃取时间、萃取流速、牛膝样品颗粒大小。

3.怀牛膝中化学成分分析方法

怀牛膝中的生物活性成分的分析测定主要有紫外分光光度法、薄层色谱法、超临界流体色谱法、原子吸收光谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。

紫外分光光度法是在190～800nm波长范围内，通过测定物质的吸光度，进而进行定性和定量测定的方法。该方法通过将特定波长范围内样品的光谱与对照光谱或对照品光谱进行比较，或通过确定最大吸收波长，或通过测量两个特定波长处的吸收比值而鉴别物质。紫外分光光度法的优点是简单、快速，缺点是显色剂的选择比较难。

薄层色谱法是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以适合的溶剂为流动相，利用各组分对同一吸附剂吸附能力不同，在流动相(溶剂)流过固定相(吸附剂)的过程中，连续地产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到混合样品中各组分的快速分离。

超临界流体色谱法是20世纪80年代发展起来的使用超临界流体作流动相的色谱技术。基于超临界流体的一系列优点，超临界流体色谱法既可以分析气相色谱不适应的高沸点样品，又比高效液相色谱有更快的分析速度和更高的分离效率，拥有气相色谱和液相色谱所没有的优点，应用范围更广泛。

原子吸收光谱法是利用气态原子吸收一定波长的光辐射后，原子中外层的电子会从基态跃迁到激发态。由于各元素的原子结构和外层电子的排布不同，外层电子从基态跃迁至第一激发态时吸收的能量不同，因而各元素的共振吸收线具有不同的特征，可作为元素定性的依据，吸收辐射的强度在线性范围内与被测元素的含量成正比，可作为定量的依据。原子吸收光谱法主要用于样品中微量及痕量组分分析，其优点是分析时间短、选择性好、准确度高、检出限低、应用范围广，其缺点是样品前处理麻烦、线性范围窄、不能实现多元素同时分析。

许海丹等[14]用乙醇沉淀干燥的牛膝粉末中的牛膝多糖，最后用乙醚、丙酮反复清洗，干燥，得到牛膝多糖固体。采用正交设计得到最佳显色条件:5%苯酚1.0 mL,浓硫酸7.5 m L,反应时间30 min。本方法采用UV-2401PC紫外-可见分光光度计测定吸光度（最大吸收波长482 nm），采用苯酚-硫酸法测定怀牛膝中多糖平均含量为29.4%。

卫修来等[15]采用高氯酸-香草醛比色法,用 721型分光光度计 (测量波长544 nm)，测定了怀牛膝中总皂苷含量。

王龙等[16]以大孔吸附树脂提取牛膝总甾酮,以50 mg·mL-1香草醛冰醋酸溶液和高氯酸作显色剂,用紫外分光光度法(测量波长550 nm)测定了牛膝总甾酮含量。

王笃学等[17]以氯仿-甲醇-甲酸为展开剂，用薄层色谱法测定了怀牛膝中齐墩果酸的含量。

吴美涵等[18]用超临界流体色谱法测定怀牛膝及其制剂中齐墩果酸的含量。

穆海风等[19]用Venusil XBP C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲酸-乙腈为流动相,流速1.0 mL.min-1,检测波长250 nm,采用高效液相色谱法比较了不同产地样品中β-蜕皮甾酮、R-牛膝甾酮和S-牛膝甾酮的含量差异。

张留记等[20]用ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm）,以乙腈磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速1.0 mL.min-1,检测波长250 nm,采用高效液相色谱法测定了怀牛膝中β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa这5种活性成分的含量，并比较了焦作16个产地样品中5种活性成分的含量差异。

李向阳等[21]以甲醇磷酸溶液为流动相，建立了反相高效液相色谱法，测定了怀牛膝中牛膝皂苷II和β-蜕皮甾酮的含量。

王建科等[22]采用火焰原子吸收光谱法，测定了怀牛膝生品及3种不同炮制品中10种微量元素的含量。

4.结语

本文综述了怀牛膝的化学成分、分离分析方法的研究状况。目前，国内外研究人员已从怀牛膝中分离出大量的甾酮和皂苷类化合物，但对化学成分的药效药理机制研究还不够。文献已报道的怀牛膝的生物活性成分的分离分析方法有很多，这些方法分离分析时间一般比较长，可以尝试缩短分离分析时间。另外，怀牛膝生物活性成分的药代动力学有待进一步研究。