微小RNA-200c在胰腺癌中的研究进展

张 尧， 张 锴， 康鹏东， 马 超

郑州大学附属肿瘤医院 肝胆胰外科， 郑州 450008

胰腺癌是一种侵袭性高、死亡率高的恶性肿瘤。由于早期确诊难、侵袭转移早、放化疗抵抗及缺乏有效的靶向治疗方案，预后较差[1]。因此，胰腺癌治疗的研究探索中，寻找可靠的生物标志物和分子靶标至关重要。近年来，随着分子生物学技术发展，微小RNA(miRNA，miR)逐渐成为研究热点，为胰腺癌研究提供新思路和方向[2]。

miRNA是一种广泛参与机体多种生物学功能的非编码RNA，主要与靶RNA的3′端非翻译区(untranslated regin，UTR)结合，导致靶RNA的降解或翻译终止[3]。研究[4]证实，多种miRNA在肿瘤中发挥癌基因或抑癌基因作用，并影响肿瘤的生物学行为。其中，miR-200家族与肿瘤的关系是近年来的研究重点[5]，目前相关研究[6-7]表明，miR-200c与胰腺癌的发生、侵袭、转移、预后等诸多方面有密切关系。本文即对miR-200c在胰腺癌中的研究进展进行综述。

1 miR-200c概述及在胰腺癌中的表达情况

miR-200家族由miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-419组成。其中miR-200c、miR-141位于染色体12p13.31，其余位于染色体1p36.33[5]。有研究[8]表明，miR-200c作为抑癌基因，在乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌等多种癌症中发挥作用，且通常经由阻断癌细胞的上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)而表现出抑癌行为。在不同肿瘤细胞系及组织中，miR-200c的表达并不完全相同。

1.1 在胰腺癌组织中的表达 miR-200c已被证实在肺癌[9]、卵巢癌[10]、肝癌等多种癌组织中低表达。Ali等[11]应用细针穿刺活检术抽取29例胰腺癌组织及15例正常胰腺组织，应用微阵列数据分析检测发现胰腺癌组织中超过228个miRNA存在异常，对前7个miRNA应用实时定量PCR技术(qRT-PCR)进一步验证，结果证实大部分胰腺癌组织中let-7c、let-7f和miR-200c表达降低，所有胰腺癌组织中miR-486-5p和miR-451表达显著升高，let-7d和miR-423-5p表达具备个体化差异。

Pan等[12]应用qRT-PCR 对胰腺癌组织及癌旁组织中的miR-200c表达进行检测后发现，miR-200c在胰腺癌组织中表达水平显著低于癌旁组织。为进一步探索miR-200c表达下调的机制，其应用时间飞行质谱技术对miR-200c启动子甲基化水平进行定量测定，结果显示miR-200c启动子高甲基化，且其甲基化水平与miR-200c表达水平呈负相关性。应用DNA去甲基化剂5-Aza-dC处理胰腺癌细胞后，miR-200c启动子甲基化水平降低，miR-200c表达恢复。在胰腺癌中，miR-200c低表达，且其表达的下调与启动子的高甲基化有关。

1.2 在胰腺癌干细胞中的表达 胰腺癌干细胞具有自我更新的能力，可能是胰腺癌发生发展的启动因子，影响胰腺癌的耐药和转移[13]。Ma等[14]以CD24+CD44+ESA+作为标志物在人胰腺癌细胞株(PANC-1)中分选出胰腺癌干细胞，应用实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-PCR)法检测miR-200c表达，发现miR-200c在胰腺癌干细胞中的表达明显低于PANC-1。转染miR-200c前体片段至胰腺癌干细胞中，高表达miR-200c后，胰腺癌干细胞体外侵袭能力明显降低。miR-200c胰腺癌干细胞中低表达并可抑制胰腺癌干细胞的侵袭能力。

1.3 在血清中的表达 循环miRNA正在成为一种有用的工具，用于各种癌症的非侵入性诊断和预后评估，Gablo等[15]前瞻性纳入112例计划进行手术切除的胰腺癌患者，把总生存期(OS)<16个月的患者归类为预后不良，OS>20个月患者归类为预后良好，qRT-PCR法检测术前血浆标本中miRNA的表达，结果显示，多种miRNA在预后不良与预后良好病例的血浆样本中存在差异化表达，其中，预后不良病例的血浆样本中，miR-200c显著高表达。miR-200c在血清中的差异化表达，提示其在胰腺癌的诊断和预后预测中具备巨大潜能和广阔应用前景。

2 miR-200c与胰腺癌的增殖、侵袭和转移

EMT使有极性的上皮细胞经过一系列变化失去细胞间联系转化为无极性的间质细胞，从而获得侵袭性和转移能力，是肿瘤早期转移的重要步骤[16]。EMT过程中伴随多种细胞分子标志物改变，包括细胞黏附蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)和γ-连环蛋白等的表达下调，而间叶细胞的标记分子如纤维连接蛋白、波形蛋白(vimentin)和N-钙黏蛋白等的表达上调，其中E-cadherin的丢失为EMT的重要特点[17]。EMT在肿瘤及肿瘤干细胞的增殖、侵袭转移进程中发挥重要作用[18-20]。多项研究[21-22]表明，miR-200c可通过抑制EMT进程发挥抑癌基因作用。

胰腺癌中，miR-200c同样参与调控肿瘤细胞EMT进程，Burk等[23]过表达胰腺癌细胞中miR-200c后，E-cadherin表达明显上调，而转染miR-200c抑制剂沉默其表达后，E-cadherin表达明显下调。说明miR-200c直接调节E-cadherin来调控肿瘤细胞EMT。进一步研究[24]证实，miR-200c可直接靶向作用于E-cadherin转录抑制因子：ZEB1/2，SNAI1/2，Twist1/2以及EMT激活剂TGFβ来抑制EMT进程。同时，ZEB1也反过来抑制miR-200c表达[25]，miR-200c和ZEB1的相互抑制形成了一个双向负反馈回路[26]共同调节肿瘤的迁徙和转移。靶向ZEB1-miR-200c负反馈通路有望成为治疗胰腺癌的基础[27]。近年来随着肿瘤干细胞研究进展，有研究[28]发现，miR-200c也参与了胰腺癌干细胞EMT过程的调控，转染前体物质使胰腺癌干细胞中miR-200c高表达后，胰腺癌干细胞中E-cadherin表达明显上调，vimentin、ZEB1表达明显下调，Transwell迁徙实验证实高表达miR-200c后，胰腺癌干细胞侵袭能力较前降低。

此外，除了调节EMT蛋白，miR-200c还影响胰腺癌细胞表面黏蛋白的表达。miR-200c直接靶向胰腺癌细胞中的黏蛋白4(MUC4)和黏蛋白16(MUC16)的mRNA来抑制MUC4、MUC16蛋白的表达[29]，从而逆转胰腺癌细胞的侵袭。miR-200c还通过其他通路调控胰腺癌细胞的浸润转移。Huang等[30]应用TargetScan数据库预测出Notch1是miR-200c的作用靶点，而Notch1被证实参与了胰腺的胚胎发育与分化[31]，在胰腺癌中起重要作用。转染miR-200c使其在胰腺癌干细胞中高表达后，Notch1免疫荧光强度降低，胰腺癌干细胞的干细胞样特性和转移潜能被抑制。miR-200c作用于Notch1的3′UTR，下调其mRNA及蛋白的表达。

也有研究[32]指出，miR-200c是转移相关肺腺癌转录本1(matastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)的直接靶点。Zhuo等[33]应用qRT-PCR检测胰腺癌组织中MALAT1和miR-200c的表达，转染MALAT-1使其高表达后，胰腺癌组织中miR-200c表达较前明显降低，同样，miR-200c高表达后，MALAT-1表达明显降低。二者表达相互抑制，可能形成一个新的反馈回路。进一步分析表明，胰腺癌组织中MALAT-1与ZEB1的表达呈正相关，miR-200c与MALAT-1、ZEB1的表达呈负相关。这一方面是因为MALAT-1可以作为竞争性内源性RNA抑制miR-200c的表达，另一方面因为miR-200c与靶RNA的3′UTR结合，沉默靶基因抑制MALAT-1表达。Transwell迁徙实验发现，MALAT-1促进胰腺癌侵袭、转移，miR-200c则起抑制作用，当同时沉默MALAT-1和miR-200c时，对比单独沉默MALAT-1，肿瘤细胞侵袭性升高，miR-200c的抑制部分逆转了侵袭性降低。

3 miR-200c与胰腺癌诊断及预后

胰腺癌因早期症状不典型、缺乏特异性诊断标志物从而难以实现早期诊断，进而导致预后不佳。如何提高胰腺癌高危人群早期筛查确诊率一直是临床工作中的重点和难点。目前，虽然miR-200c等因子在胰腺癌患者血清中的表达变化已有相关研究报道，提示与患者预后相关，但miR-200c在胰腺癌中的诊断价值仍需进一步大样本研究。miR-200c等因子与血清肿瘤标志物联合检测，多指标共同诊断或能提高胰腺癌的诊断准确度。

miR-200c在胰腺癌组织中及患者血清中的表达均提示与预后相关。Soubani等[34]从99例施行胰十二指肠切除术的患者中获得胰腺癌组织，qRT-PCR法检测miR-200c表达并分为高表达组和低表达组，分析其与预后的关系。结果显示，miR-200c的低表达与胰腺癌的淋巴结转移、TNM分期、血管浸润(阴性或阳性)显著相关；高表达miR-200c组OS更长。一项关于miRNA与胰腺癌预后的Meta分析显示[35]，miR-200c低表达患者生存期明显缩短，提示miR-200c低表达是手术切除后患者预后不良的重要预测。Gablo等[15]的前瞻性临床试验发现循环miR-200c的表达与患者OS相关，提示血浆中miR-200c可能作为生物标志物来监测肿瘤动态和预测胰腺癌患者预后。因此，组织miR-200c的低表达一定程度上可以提示癌症患者的不良预后，然而，晚期癌症患者中，循环miR-200c的高表达则提示患者的预后不良。

4 miR-200c与胰腺癌治疗

miR-200c与化疗耐药密切相关，Li等[36]将胰腺癌细胞分为吉西他滨敏感和吉西他滨耐药，检测两组胰腺癌细胞中miRNA的表达，发现吉西他滨耐药细胞中miR-200b、miR-200c、let-7b、let-7c、let-7d和let-7e的表达显著下调，而E-cadherin、vimentin、ZEB1等蛋白高表达。研究[37]发现，ZEB1和其他EMT调控因子可能维持人胰腺癌细胞的耐药，进一步实验证实，miR-200c靶向沉默ZEB1，不仅上调了E-cadherin的表达，还增加了其他上皮标志物，如EVA1和MAL2的表达，恢复了胰腺癌细胞对吉西他滨、5-氟尿嘧啶、顺铂等药物的敏感性。探索miRNA与胰腺癌传统治疗的相互关系，可以为胰腺癌的治疗打开新的突破口。miRNA与化疗药物的联合治疗也是一个潜在的、有前景的研究方向，既可以利用miRNA的优势靶向多个信号通路，又可以发挥抗癌药物的细胞毒性作用、减少胰腺癌细胞的化疗耐药性[38-39]。

随着技术手段的不断进步，许多临床研究开始探索miRNA在临床治疗中的应用。miRNA应用于肿瘤治疗，主要依靠直接或间接下调原癌miRNA的表达或上调抑癌miRNA的表达来实现[2]。治疗性miRNA必须通过多重生物屏障，包括全身血液环境、肿瘤组织和肿瘤细胞微环境等[40]，靶向调节目标miRNA的表达。在这个过程中，为提高miRNA的生物稳定性和靶向治疗性，常借助脂质载体、细胞外囊泡、miR-纳米颗粒结合物、miR海绵等各种运载工具[41]。抑癌性miRNA如miR-200c再表达具有广泛的应用前景和临床意义，但需要进一步研究相应的模拟剂和发现更有效的运载系统，从而得以应用于临床治疗。

5 小结与展望

近年来，胰腺癌发病率呈不断攀升趋势，对于胰腺癌的发病机制、诊断、治疗的研究仍未取得突破性进展。miRNA作为备受关注的研究热点，已经证实在多种肿瘤的增殖、侵袭、转移中起到相关作用。miR-200c在胰腺癌中发挥着抑癌基因作用，通过靶向调控下游基因及调控相关信号通路来抑制胰腺癌的浸润与转移，并可作为评估预后的有效分子标志物，辅助临床诊断。

随着技术手段的不断提高，对miRNA的研究也逐渐从基础方向至临床应用方向转化，越来越多的研究关注到非病毒载体介导的miRNA运载在胰腺癌治疗中的应用。但是，miR-200c是否可以作为肿瘤治疗剂仍需进一步体内动物实验及临床试验证实。miR-200c与传统肿瘤治疗手段的关系及与其他miRNA间的相互作用关系或成为下一步临床研究的重点。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：张尧负责文献整理，撰写论文；张锴、康鹏东参与查阅文献，修改论文；马超负责拟定写作方向，指导撰写文章并最终定稿。