囊型棘球蚴病的免疫预防现状

李文桂 李用国

包虫病又称棘球蚴病，常分为囊型棘球蚴病(CE)和泡型棘球蚴病(AE)。其中CE是由细粒棘球绦虫(Eg)的续绦期幼虫寄生在人体肝、肺等脏器引起的一种严重危害人类健康的人畜共患寄生虫病，是国家卫生健康委员会规划防治的重点寄生虫病之一。本病呈全球性分布，主要流行于牧区和半牧区。我国主要流行或散发在西北、华北、东北及西南广大农牧区的23个省、市和自治区，以新疆、甘肃、宁夏、青海、西藏、四川西北部和陕西多见。近年普查发现有100余万包虫病现症患者，受威胁人口达数千万，包虫病畜超过4 000万头，每年新发病畜达800余万头，年经济损失超过10亿元。该病已经成为西部牧区群众因病致贫、因病返贫的主要原因。随着现代社会的发展及人口流动的增加，宠物犬和经济动物狐狸的养殖数量日益增多，导致包虫病从我国西北部向东南部、由畜牧地区向农业地区蔓延扩散。因此，CE的防治已成为目前研究的热点领域。

健康教育是预防CE的根本措施，外科手术是已发CE患者的首选治疗方法，但对人体损伤较大，且手术后复发率较高，可达7.0%～30.1%；对于早期小棘球蚴或难于手术的患者可采用化疗药物或中药进行治疗。这些化疗药物包括阿苯哒唑、甲苯咪唑、氟苯咪唑、噻苯咪唑、丙硫咪唑、硝唑尼特、甲氟喹、三苯氧胺、苯硫氨酯、吡喹酮或奥芬哒唑等。中药包括白花杜鹃、菖蒲、姜黄、蛇麻子素、阿魏酸、青蒿素、大黄、藏红花、砂生槐生物碱、石蒜、雄黄、肉桂、石榴皮、麝香草酚、香芹酚、野蔷薇提取物、汉防己甲素、摈榔、紫堇、露蜂房、二十五味铜灰散、铁筷子多糖、聚乙烯吡咯酮-碘、骆驼蓬、消包汤或复方消包片等。临床发现这些药物存在严重的不良反应，部分患者不能耐受，同时患者对某些化疗药物可产生耐药性。因此，需要研究对CE更有效的防治措施。

Baron等[1]在1976年发现巨噬细胞和补体可在体外杀伤Eg原头蚴。Deplazes等[2]在1994年证实感染Eg的犬淋巴结细胞增殖，血免疫球蛋白(Ig)G、IgE和IgA水平均升高。Rigano等[3]在1997年发现CE患者外周血单核细胞产生的干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-4、IL-5、IL-6和IL-10水平均升高。上述资料均表明宿主在防御Eg的感染过程中不仅有非特异性反应参与，而且有辅助性T细胞(TH)1、TH2和体液免疫应答参与，这为研制Eg疫苗提供了理论依据。

Eg疫苗研究已有70余年历史，大体上经历了灭活疫苗、分子疫苗、合成肽、DNA疫苗和载体介导的疫苗这几个研究阶段。病毒和细菌的减毒株是常见的疫苗载体，这些载体介导的疫苗具有灭活疫苗和活疫苗的优势，能主动感染宿主细胞，协助外源基因有效进入细胞，产生细胞因子和趋化因子，从而诱导长期的免疫应答。本研究拟概述CE免疫预防的研制现状。

一、灭活疫苗

Turner等[4](1936年)、Movsesijan等[5](1968年)、Herd等[6](1975年)和Heath等[7](1979年)用Eg虫卵、六钩蚴或原头蚴的分泌物及其匀浆接种绵羊或小鼠后再用Eg虫卵口服攻击，发现这些动物均可产生不同程度的保护力，但抗原大批量供应限制了其广泛应用。

二、重组抗原疫苗

常见的重组抗原包括Eg95、EgA31、Eg14-3-3、EgM123、EgG1Y162、Egferr、P29、EgHSP20、EgM4、EgM9、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、转酮醇酶、磷酸丙糖异构酶、硫氧还蛋白过氧化物酶、亲肌蛋白和原肌球蛋白等，它们均为已经报道的疫苗分子。

1.Eg95抗原

Eg95抗原的疫苗种类包括重组蛋白、合成肽和DNA疫苗等[8]，将它们分别接种于BALB/c鼠、山羊和绵羊均可产生有效的保护性免疫应答。Lightowlers等[9]采用Eg天然六钩蚴抗原(23～25 kDa)的抗血清扫筛Eg六钩蚴cDNA文库得到1个克隆，命名为Eg95；将其亚克隆至pGEX-3构建pGEX-Eg95，转染大肠埃希菌后可表达为Eg95-GST融合蛋白；将其皮下注射6月龄绵羊，Eg虫卵口服攻击可产生96%～98%的减蚴率。刘丹等[10]将348 bp的Eg95编码基因经聚合酶链反应(PCR)连接为3Eg95串联基因，插入pET32α得pET32α-3Eg95，转化BL21(DE3)菌，IPTG诱导表达后经SDS-PAGE显示重组菌可表达56 kDa的3Eg95-His融合蛋白。贾红等[11]将3Eg95-His融合蛋白加弗氏佐剂皮下注射BALB/c鼠，在免疫后2周和4周加强2次，在免疫后6周发现血清IgG和IFN-γ水平均升高。李玉娇等[12]采用生物信息学技术预测Eg95抗原存在7个T/B细胞的抗原表位。兰希等[13]将Eg95-1(1-70aa)、Eg95-2(51-106aa)和Eg95-3(89-153aa)合成肽混合，将混合肽加弗氏佐剂皮下注射绵羊，在初次免疫后2、4和6周重复3次，初次免疫后10周提示血清IgG水平升高，脾脏细胞增殖。林仁勇等[14]将Eg95基因插入pCDNA3.1得pCD-Eg95；将100 μg的pCD-Eg95皮下注射BALB/c鼠，在初次免疫后2、4、6和8周重复4次，初次免疫后2～10周显示鼠血清IgG和IgG2a水平均升高，初次免疫后10周显现脾脏细胞明显增殖。

2.EgA31抗原

Fu等[15]采用Eg感染的犬血清扫筛Eg六钩蚴cDNA文库得到一个克隆，命名为EgA31；将50 μg的EgA31-GST融合蛋白皮下注射8月龄犬可诱导有效的免疫应答。李玉娇等[16]推测EgA31存在4个T/B细胞表位。而赵骁等[17]推测EgA31存在4个T淋巴细胞(简称T细胞)表位、6个B细胞表位和1个T/B细胞联合表位。张杰等[18]将1 362 bp的EgA31-EgY162融合基因插入pET30α后转化大肠埃希菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析显示可表达58 kDa的EgA31-EgY162融合蛋白。

3.Eg14-3-3抗原

李宗吉等[19]将10 μg的Eg14-3-3融合蛋白加弗氏佐剂皮下注射ICR鼠，在初次注射后2周和4周加强2次，初次注射后4～10周发现血清IgG、IgG1和IgG2a水平均升高；脾脏细胞增殖，分泌高水平IL-2和IFN-γ；此时腹腔注射1 500个Eg原头蚴进行攻击，在攻击后6个月表明Eg14-3-3免疫鼠的包囊抑制率可达84.47%。王强等[20]将10 μg融合蛋白加弗氏佐剂皮下注射ICR鼠，在初次接种后2周和4周加强2次，在初次接种后8周腹腔注射1 500个Eg原头蚴进行攻击，在攻击后6个月显示免疫组的脾脏细胞增殖，脾脏CD4+T细胞的数目增加,包囊抑制率可达85.3%。

4.EgM123抗原

齐文静等[21]将25 μg的EgM123-CTB蛋白皮下注射BALB/c鼠，在初次免疫后的2周和4周加强2次，初次免疫后的6周显示血清IgG水平升高，滴度可达1∶320 000，肠黏液sIgA水平增多；然后将100 μg融合蛋白皮下注射比格犬，在初次注射后的2周和4周加强2次，初次注射后6周显示血清IgG水平升高，滴度可达1∶64 000。

5.EgG1Y162抗原

赵商岐等[22]等发现EgG1Y162蛋白具有3个T细胞表位和2个B细胞表位。刘晓霞等[23]将50 μg的EgG1Y162蛋白加弗氏佐剂皮下注射BALB/c鼠，在初次免疫后2、4和6周加强3次，初次免疫后10周显示血清IgG水平升高，滴度可达1∶25 600，脾脏细胞增殖，脾脏细胞的凋亡数目减少。

Zhang等[24]将50 μg的EgG1Y162-1/2蛋白加弗氏佐剂皮下注射BALB/c鼠，在初次注射后8周达较高水准，滴度可达1∶5 120～1∶20 480；脾脏细胞增殖，脾脏CD4+和CD8+T细胞的数目增加，产生高水平的IFN-γ；脾脏细胞凋亡发生率降低；在初次注射后11周腹腔注射1 000～2 000个Eg原头蚴进行攻击，在攻击后19周表明免疫组的Eg包囊数目和重量降低，囊重抑制率为58.10%～64.10%，血清IgG水平升高，该血清可在体外杀伤Eg原头蚴。

6.Egferr抗原

对于大多数生物而言，铁是有机体内酶促和生化反应所必须的元素之一，它必须与铁蛋白(Ferr)结合才能发挥运输氧和转运电子的功能。王娅娜等[25]将50 μg的Egferr-GST融合蛋白加弗氏佐剂皮下注射BALB/c鼠，在初次免疫后2周和4周加强2次，初次免疫后6周显示血清IgG水平升高，此时腹腔注射3 000个Eg原头蚴进行攻击，在攻击后6个月表明免疫组的包囊抑制率可达86.5%。

三、病毒载体介导疫苗

病毒载体介导的疫苗种类包括牛痘病毒疫苗(rMVA-Eg95)、羊口疮病毒疫苗(rORFV-Eg95)、山羊痘病毒疫苗(rGPV-Eg95)和狂犬病毒疫苗(rRABV-Eg95)[8]，将它们免疫BALB/c鼠和绵羊均可对抗Eg虫卵或原头节的攻击感染。

高度减毒的牛痘病毒(MVA)对人体安全无毒，有多个非必需区，可插入外源基因，是一种疫苗载体。Marsland等[26]构建了rMVA-Eg95疫苗；Dutton等[27]将108PFU重组病毒滴鼻接种BALB/c鼠和绵羊，在初次滴鼻后4周强化1次，在第1次滴鼻后6周出现血清IgG水平升高；体外实验显示该血清可杀伤Eg原头蚴，小鼠和绵羊血清的杀蚴滴度分别为1∶512和1∶64。

羊口疮病毒(ORFV)是一种嗜皮肤的病毒，病毒粒子表面包绕多种表面蛋白，其中ORF104和ORF059蛋白的编码基因存在多个非必需区，可插入靶基因，是一种疫苗载体。Tan等[28]将Eg95基因插入p699得到pVU700，将F1L基因插入pVU700得到pVU701，加入羊口疮病毒的N22株转染LTCs细胞株，筛选培养后经免疫杂交表明Eg95抗体识别重组病毒表达33 kDa的Eg95-F1L融合蛋白；将108PFU重组病毒皮下注射绵羊，在初次注射后5周皮下注射重组Eg95蛋白加强1次，在第1次注射后7周显现血清IgG水平升高，滴度可达1∶100 000。

山羊痘病毒(GPV)的基因组大小为150 kb，删除胸腺激酶编码基因的减毒株是一种理想的疫苗载体。Liu等[29]将Eg95基因插入pLSEG得到pLSEG-Eg95，加入羊痘病毒转染LTCs细胞株，筛选培养经免疫荧光提示重组病毒能够呈现Eg95蛋白的分子。

狂犬病毒(RABV)的减毒株是一种有效的疫苗载体。许彤等[30-31]构建了rRABV-Eg95疫苗；将1×106.5TCID50重组病毒肌肉注射BALB/c鼠，在注射后2周经ELISPOT显示脾脏IFN-γ+T细胞和IL-4+T细胞的数目增加；流式细胞仪检测结果提示脾脏树突状(DC)细胞和B细胞的数目增多；在注射后4周显现血清的中和抗体和IgG水平升高；在注射后8周肌肉注射100平均半数致死量(MLD50)的RABV有毒株进行攻击，在攻击后3周提示免疫组和对照组的存活率分别为100%(8/8)和0%(0/8)。

四、细菌载体介导疫苗

细菌载体介导疫苗种类包括鼠伤寒沙门氏菌疫苗(rSt-Eg95/Eg95-Ferr/FABP)、卡介苗疫苗(rBCG-Eg95/EgM123/EgG1Y162)、根癌农杆菌疫苗(rAt-Eg95-EgA31)和两歧双歧杆菌菌苗疫苗(rBb-Eg95-EgA31)[8]。

鼠伤寒沙门氏菌(St)是一种胞内寄生菌，可有效表达插入的外源基因。Eg缺乏脂肪酸结合蛋白(FABP)，必须从宿主体内摄取，对Eg的生存具有重要意义。Chabalgoity等[32]构建了rSt-FABP疫苗；将106CFU疫苗尾静脉注射或109CFU疫苗灌胃接种BALB/c鼠，在初次接种后4～6周发现灌胃接种组诱导的抗FABP抗体水平高于静脉注射，血清IgG1、IgG2a和IgA水平均升高；脾脏细胞增殖，产生高水平的IL-2、IFN-γ和IL-5等。王志升等[33]构建了rSt-Eg95-Ferr疫苗，将BALB/c鼠口服1010CFU疫苗，在初次口服后2周强化1次，在初次口服后6周出现血清IgG升高，脾脏细胞增殖。

卡介苗(BCG)是一种活的减毒结核菌株，是一种理想的疫苗载体。李文桂等[34-35]构建了rBCG-Eg95疫苗；用rBCG疫苗接种BALB/C鼠8周后，再用100个活的细粒棘球蚴给每只鼠腹腔接种进行感染，在攻击感染半年后剖杀各组小鼠，发现各组减蚴率为18.20%～92.46%；在疫苗免疫后8周发现血清IgG、IgG2a和IgG2b水平均升高，IgG1、IgG3和IgE水平均降低；脾脏细胞CD4+亚群显著增加，CD8+亚群轻微升高；脾脏细胞上清液IFN-γ和TNF-α水平均升高，IL-2无变化，IL-4水平降低；在疫苗免疫和棘球蚴攻击后发现脾脏CD4+T细胞的凋亡降低，提示该疫苗可诱导小鼠产生一个Th1型保护性免疫应答。

何黎等[36]以pET28α-EgM123为模板扩增594bp的EgM123基因，插入pMV261得pMV261-EgM123，将其电穿孔转化耻垢分支杆菌，筛选培养后经免疫印迹表明患者血清识别30KDa的EgM123蛋白；将106CFU疫苗皮下注射BALB/c鼠，血清IgG在注射后2～8周升高，在8周达较高水平。

祖力皮也等[37]构建了rBCG-EgG1Y162疫苗，李玉娇等[38-39]将105CFU疫苗皮下或腹腔注射BALB/c鼠，在初次注射后8～10周发现血清IgE、IgG1、IgG2a和IgG2b水平均升高，此时腹腔注射1 000个Eg原头蚴进行攻击,在攻击后10～12周显示免疫组囊重抑制率为78.1%；血清IgG、IgG2a和IgG2b水平均升高,但血清IgG1水平降低；血清Tim-3因子及其配体Galectin-9水平均下降；血清IL-2和IFN-γ水平均升高,但IL-4水平降低；流式细胞仪检测结果显示外周血淋巴细胞Tim-3+和CD4+数目增加,但CD8+细胞的数目减少。

苜蓿(Medicago sativa)是一种优良的豆科牧草，Deak等[40]和Shahin[41]分别通过农杆菌转化法将nptⅡ基因导入苜蓿，并获得了可育抗性植株，这为研制转基因苜蓿提供了可行性。周辉和李文桂[42]构建了转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗；叶艳菊和李文桂[43]发现，疫苗免疫及原头节攻击后口服转基因苜蓿接种组小鼠检获包囊重量降低，囊重减少率为64.1%，脾脏细胞凋亡发生率降低，脾脏T细胞增殖水平、CD4+T细胞亚群百分比和CD4+/CD8+比值升高，血清IgG、IgG2b和IgE水平均升高，脾脏细胞培养上清液IFN-γ、1L-12和TNF-α水平均升高，IL-10水平均降低，表明该疫苗口服接种可抑制脾脏细胞发生凋亡，诱导脾脏T细胞增殖，产生Th1细胞免疫应答以对抗Eg原头节的攻击感染，CD4+T细胞亚群、IgG、IgG2b和IgE在疫苗诱导的保护力中起重要作用。

双歧杆菌(Bb)的细胞壁厚且复杂，摄取外源DNA较为困难。Rossi等[44]用电穿孔方法进行外源DNA转化Bb试验，并摸索出了较好的转化条件。周必英和李文桂等[45-46]构建了rBb-Eg95-EgA31疫苗；在疫苗免疫及原头节攻击后发现皮下注射组、肌肉注射组、鼻腔黏膜接种组和口服免疫组的囊重减少率分别为45.33%、41.33%、70.67%和62.67%；血清IgG、IgG2a、IgG2b和IgG1水平均升高，IgG3和IgE水平均降低；脾脏IFN-γ、IL-12和TNF-α水平均升高，IL-10水平降低；脾脏淋巴细胞增殖；脾脏CD4+和CD8+T细胞增加；脾脏细胞的凋亡发生率降低，表明该疫苗免疫可抑制脾脏细胞发生凋亡，诱导脾脏T细胞增殖，产生以Th1型为主的细胞免疫应答。

五、小结

尽管现有Eg疫苗均可诱导宿主产生一定的保护力，但它们诱导的保护力尚未达到人们所期望的水平，同时这些疫苗还存在下述缺点：由于很难成批供应大量Eg虫卵或六钩蚴，因而用其免疫接种在实际工作中受到限制；重组蛋白要经过基因克隆、表达和蛋白纯化等复杂过程，成本高，同时只能诱导体液免疫和Th细胞应答，但不能诱导细胞毒性T细胞应答(CTL)；尽管合成肽的化学成分明确，易于大量合成，性质稳定，但其免疫原性较弱，几乎不能诱导宿主产生保护性免疫应答；DNA疫苗操作简单，能同时诱导体液免疫、Th细胞和CTL应答，但DNA可能整合到宿主细胞的基因组中，有引起原癌基因活化和抑制基因失活的风险；病毒载体的自身蛋白及其双链RNA具有免疫佐剂效应，但病毒载体自身具有潜在致癌和致病性，人群普遍具有抗病毒抗体，影响其免疫效果；重组沙门氏菌苗的表达产物与天然蛋白存在差异，表达水平较低；重组BCG疫苗生长缓慢，营养要求高，培养一代需10多个小时；转化效率低，外源基因的表达需特殊载体等；转基因植物疫苗很少被公众认可和接受；重组Bb疫苗长期低剂量口服有可能产生免疫耐受现象。因此，还需要开发新的疫苗载体，把Eg疫苗的研究推向一个新的高度。

现有研究表明，单核增多性李斯特菌、枯草芽孢杆菌、乳球菌、牛疱疹病毒Ⅰ型、犬腺病毒2型、火鸡疱疹病毒、委内瑞拉马脑炎病、水疱性口炎病毒、黄热病毒、新城疫病毒、鸡痘病毒、流感病毒、Semliki森林病毒等病原体都是有效的疫苗载体[47-60]，构建这些载体介导的Eg疫苗用可能具有极为广阔的开发应用前景。

随着科技的进步，人们将对Eg的基因组学、蛋白质组学、代谢组学、转录组学以及表观遗传学等进行深入探索，从而阐明Eg蛋白的结构与功能的关系，筛选新的抗原分子，构建多价高效的复合基因疫苗或含有基因佐剂的混合基因疫苗或多表位疫苗。Eg的生活史复杂，不同发育阶段的免疫原性和抗原构成有差异，各阶段都有保护性抗原，不同种株的免疫原性不同，筛选具有种间交叉免疫保护的高度保守性共同抗原，对不同虫种不同阶段的保护性抗原进行鉴定和分离，筛选保护性强的抗原，将其联合制成多价疫苗。关注Eg的虫株变异与宿主遗传的关系，探索基于类转录激活因子效应的核酸酶(TALEN)或基于CRISPR/cas9的基因编辑技术用于疫苗研究，探究这些疫苗的免疫原性、转化效率、主要组织相容性复合体(MHC)限制性以及能否长期在宿主体内表达，研究新型佐剂、疫苗载体和制备融合蛋白，提高疫苗的免疫原性，在宿主体内准确评估新型疫苗分子的保护性免疫机制，摸索纳米微粒技术引入新型疫苗是否可延长免疫应答的时间，诱导记忆性T细胞的产生等这些问题均有助于拓展载体介导的Eg疫苗的应用前景。