RPE与VEGF-A间的相互作用在年龄相关性黄斑变性发病机制中的研究进展

何广辉 陈松

年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration, AMD)是一种多因素诱发的与年龄相关的黄斑疾病。早期病变仅表现为玻璃膜疣形成，对患者视功能影响较小。进展期病变分为干性和湿性：干性AMD病变特点为缓慢进展的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞变性及光感受器细胞凋亡，最终表现为地图样萎缩，患者视力低下；而湿性AMD则以脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)形成为主要病变特征，由于CNV管壁结构不完善常自发破裂导致引起视网膜下出血，脂质沉积及纤维瘢痕形成，破坏RPE细胞，继而光感受器细胞损伤，造成的永久性中心视力丧失[1]。两种类型AMD的结局均以RPE结构遭到破环而告终。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是维持人体血管系统平衡的重要因子[2]，在眼底，VEGF主要由RPE分泌产生，正常量的VEGF对脉络膜血管的构建及维持稳定发挥了重要作用，但当眼部内外环境遭受刺激，RPE分泌VEGF水平异常时，眼底病变就会产生[3]。VEGF家族包含5个亚族：A、B、C、D和胎盘样生长因子(placenta growth factor，PGF),VEGF-A与眼内新生血管生成密切关联[4]。研究表明两种类型AMD的发病过程中，VEGF-A水平均表达异常[5]。本文归纳近年相关文献，就RPE与VEGF-A之间的相互关系，及二者在AMD发病进程中的相互作用进行综述。

一、生理状态下的RPE与VEGF-A

1.眼球发育过程中的RPE与VEGF-A 在胚胎发育第9周，VEGF-A即开始在胚眼内表达，在此期间，视泡具有多分化潜能，每个视泡细胞均表达相同的转录因子，使其具有转变为各种眼部细胞的能力[6]。在眼发育过程中早期VEGF-A的表达作用之一是促进脉络膜发育，使脉络膜在视杯形成时环绕在外，此后VEGF-A进一步调节脉络膜血管化过程。视网膜多种细胞均可以产生VEGF-A，例如节细胞和Muller细胞等，但主要来自于RPE的分泌[7]。在经过RPE细胞去VEGF化处理的鼠模型中，脉络膜毛细血管不发育，RPE表现为不连续的单层结构[8]。在产后第一周，RPE细胞开始与其周围散在表达的VEGF受体(vascular endothelial growth factor recepter，VEGFR)2结合，光感受器在产后第7周开始形成外层和突触，而大约在产后第8周，视网膜深层血管复合体开始发育[9]。中和RPE细胞分泌的VEGF-A将导致细胞死亡，而在体内中和VEGF-A则导致RPE/脉络膜复合体的短暂缺陷，包括液泡化，光感受器外层的丧失及脉络膜毛细血管窗减少，这证实了RPE中VEGF-A自分泌的作用及脉络膜毛细血管的旁分泌作用[10]。Byeon等[11]研究证实通过VEGFR2/PI3K/Akt等细胞因子调节的VEGF自分泌通路增强了氧化应激条件下RPE细胞的存活率。

2.体内外VEGF-A抑制后对于RPE的影响 VEGF-A不仅影响RPE细胞的生存，而且影响RPE功能。体外研究显示，与贝伐单抗共培养的RPE细胞吞噬作用明显减弱[12]。RPE的微绒毛结构由内部密集的肌动蛋白束构成，并包括EBP50和埃兹蛋白，VEGF-A在维持RPE微绒毛的结构中发挥了重要作用[13]。先兆子痫的患者由于可溶性VEGFR1的过表达，显示出足细胞埃兹蛋白的减少[14]；与此类似的是，埃兹蛋白去除的鼠模型显示出RPE顶部微绒毛减少及底部内折[15]，上述研究提示我们在VEGF抑制后，光感受器外节由于微绒毛结构破坏会吞噬作用受到影响。这同样对于目前应用抗VEGF药物治疗AMD起到提示作用，那就是过度的抗VEGF作用会影响光感受器外节的吞噬作用。

在体内，持续性的VEGF-A表达下调后，RPE和脉络膜毛细血管均具备自我修复能力。VEGF受体络氨酸激酶抑制因子作用导致VEGF-A阻断时，血管窗样结构的自我修复受到抑制，例如脉络膜血管丛和肾脏，只有VEGF-A阻断被解除，毛细血管才会重新生长[16]。在全身VEGF抑制状态下，局部RPE分泌的VEGF-A增加则对于RPE的再生起到了补偿作用。此外，在氧化应激条件下，神经营养因子的表达增加会增强RPE生存率，对于RPE的再生也发挥了一定作用[17]。在VEGF抑制状态下，VEGF-A表达反馈性上调在鼠类早产儿视网膜病变模型中亦可观察到，在注射抗VEGF药物后第一天，视网膜内VEGF-A的水平明显增加[18]。在单独及联合使用抗血管生成药物的研究中也观察到了补偿性的VEGF-A增加[19]。在体内其他部位，VEGF抑制将导致不同的结构损伤，例如脑部脉络丛血管灌注的降低，眼部视网膜神经元的凋亡，以及肾小球内皮细胞增生等[20]。在体外试验中，VEGF抑制条件下并没有导致细胞本身反馈性VEGF-A表达上调，这可能是外界培养系统没有完整复制体内生长环境所致[21]。细胞本身存在VEGF-A自分泌可以维持自身增殖，如体外培养的肾足细胞系，随着细胞分化，VEGF-A及VEGFR2表达均有增加, 此外，表达上调的VEGF-A使细胞凋亡率降低了40%，而VEGF抑制后将导致凋亡率提高2倍[22]。在体内，VEGF抑制的首要副作用是蛋白尿，常常继发于肾小球毛细血管的损伤,因而对于正常的肾足细胞及RPE细胞， VEGF抑制将导致组织损伤及毛细血管渗漏[23]。所以针对于眼底局灶性的CNV，抗VEGF治疗对于局部异常高分泌的VEGF-A具有良好抑制作用，从而使CNV病灶缩小，局部水肿减轻；但对于病灶区以外的正常RPE的基础分泌VEGF-A同样具有抑制作用，这就会为正常RPE细胞带来损伤的风险。

二、影响RPE/脉络膜分泌VEGF-A的相关因子及补体

RPE/脉络膜复合体是由RPE，Bruch’s膜及脉络膜等高分化组织构成，其顶部和基底部的VEGF-A具有不同的功能：顶部分泌的VEGF-A具有神经保护作用，而基底部分泌的VEGF-A具有维护脉络膜毛细血管的作用，并且基底部分泌的VEGF-A要高于顶部[24]。

1.PGF与VEGF-A PGF主要是RPE/脉络膜复合体基底部分泌产生，顶部分泌极少。在健康组织中，PGF不会产生任何作用，而当缺血状态及病理性血管形成时，PGF则与VEGF-A协同发挥作用[25]。迄今为止，PGF的生理作用仍未被完全阐明，其在生理性血管生产成过程中的作用微乎其微，但在脉络膜中大量分泌的PIGF则具有重要意义，即提高VEGF-A的效力[26]。因此，PIGF与VEGF-A在维持脉络膜稳定过程中共同发挥了作用。

2.转录因子对于VEGF-A及PIGF分泌的调节 在VEGF-A分泌过程中，转录因子NF-KB和SP-1发挥了作用。SP-1抑制VEGF-A的作用非常强，这与肺癌细胞中的研究相吻合[27]。而细胞因子诱导的RPE细胞分泌VEGF-A则不受SP-1调节，证实SP-1仅是基本通路的组成部分而非决定部分[28]。p38蛋白则主要是影响RPE/脉络膜复合体基底部的VEGF-A分泌，其不仅仅在VEGF-A的基础分泌时发挥调节作用，在高温情况下，p38蛋白也能够促进VEGF-A分泌；但对于氧化应激状态下VEGF-A的高表达，p38蛋白则未发挥明确作用[29]。这提示在不同病理状态下，相应的细胞内信号通路参与了RPE/脉络膜复合体顶部及基底部的VEGF分泌调节。在氧化应激状态下RPE细胞通过自我保护机制保护光感受器，而高温状态时，脉络膜循环则发生了改变，因此，VEGF的分泌是根据内外刺激不同情况的精密调节的[30]。VEGFR-2参与了RPE/脉络膜复合体顶部VEGF-A调节，并且只存在于RPE/脉络膜复合体中，通过VEGFR-2参与的顶部VEGF-A分泌调节显示了RPE的自分泌作用，这显示了RPE对抗氧化应激的自我保护功能[31]。NF-KB和SP-1不仅对VEGF-A起到调节作用，而且对于PGF也能进行调节，在胚胎肾细胞中，NF-KB对于PGF的表达起到了明显调节作用[32]。另有研究证实了RPE/脉络膜复合体基底部PGF的调节主要通过VEGFR-2来实现，但PGF并没有与VEGFR-2直接捆绑，提示了VEGF-A有可能通过VEGFR-2活化来上调PGF表达，这就证实了PGF和VEGF-A协同发挥作用的观点33]，因此抑制PGF的对于病理性新生血管生成也能起到抑制作用。

3.补体调节蛋白CD46对于RPE分泌VEGF-A的调节 补体系统激活对于促进RPE细胞或是AMD动物模型分泌VEGF具有促进作用[34]。Vogt等[35]通过免疫组化实验发现，在人眼RPE基底部，CD46是唯一的补体激活膜限制性调节因子。而尽管CD46 与RPE萎缩之间的关系仍未能完全阐明，但CD46在人bruch’s膜表面RPE细胞维持稳态方面起到了关键作用[36]。地图样萎缩患者的RPE表达CD46明显下降，并且是渐进性的[37],因此，CD46是健康RPE表型的重要组成部分，而CD46缺失将导致疾病进展。研究发现RPE-CD46表达改变将逐渐导致视网膜形态改变，即从健康状态转变为地图样萎缩，而在疾病早期，也就是RPE细胞形态正常时，就能够检测出CD46表达的变化[37]。这说明在普通粘附机制作用下，存在由RPE细胞关联蛋白构成的功能单元，来维持RPE的正常形态而避免增生或迁移。有研究显示，CD46阴性实验鼠由于补体抑制不足，VEGF分泌量增加而更容易产生实验性CNV，并且经腺病毒转染的人CD46表达增加能够降低补体介导的实验鼠眼部损伤[38]。这说明在像AMD这类疾病发展过程中，CD46起到了视网膜保护作用。

三、RPE, VEGF-A与AMD

1.湿性AMD 在湿性AMD中CNV突破RPE渗透到视网膜下间隙，使RPE屏障被破坏，从而使RPE得功能受损[39]。局部异常分泌增多的VEGF-A不仅仅刺激内皮细胞增殖和迁移，促进新生血管生成，它还能起到破坏RPE屏障的作用[40]。研究发现，在体外用VEGF-A处理单层RPE后，RPE的屏障作用减弱，增加了跨屏障的分子流动[41]。人类RPE细胞除了表达VEGF-A之外，还表达VEGF-A受体，包括VEGFR1和VEGFR2。研究显示VEGF-A不仅在VEGFR1上游通路的激活中起到重要作用，还可以诱导VEGFR2下游通路的激活，VEGF-A可以通过自分泌或旁分泌的途径激活RPE细胞VEGFR2的信号通路，总而促进nAMD病程不断进展，RPE细胞不断损伤[42]。而VEGF-A高分泌的鼠类动物模型显示出随着年龄增长而逐渐发展的RPE屏障功能减弱，使得紧密连接处的屏障蛋白细胞质解聚，在此类鼠类模型中，随着RPE屏障破坏，CNV发生发展[43]。因此，在湿性AMD的发展过程中，VEGF-A水平增高与CNV形成和RPE功能异常息息相关。

2.干性AMD 干性AMD的特征是伴随年龄增长的RPE细胞和Bruch’s膜的结构逐步破坏，最终造成光感受器结构功能异常[44]。干性与湿性AMD虽然临床特征不同，但研究显示，两类AMD可以交叉发生，干性AMD患者可以发展为湿性AMD[45]。遗传学研究已经确定此类进展性AMD的遗传位点, 有关基因组研究分析显示，干性和湿性AMD都与VEGF-A基因位点有关[46]。动物研究显示，高VEGF-A表达的鼠类模型中不仅表现出湿性AMD的机构特征，而且表现干性AMD的结构特征，这些鼠类模型不仅表现出VEGF-A诱导的RPE屏障损伤，CNV形成并延伸到视网膜下，而且表现出年龄相关的RPE和视网膜萎缩及RPE下的层状颗粒物沉积[47]。Ablonczy等[48]研究发现，在高VEGF-A鼠模型中，RPE屏障破坏要早于视网膜异常及光感受器损伤出现，研究结果显示VEGF-A除了导致CNV形成之外，还通过损伤RPE屏障，影响在RPE细胞和光感受器之间的视黄酸转运途径，从而导致光感受器功能异常。由此可见，VEGF-A在干性AMD发病过程中也发挥了重要作用。

3.抗VEGF药物与RPE 抗VEGF药物已经广泛被用于湿性AMD的治疗，并取得了不错的临床效果[49]。但是研究发现，在一些病例中长期使用抗VEGF药物治疗，湿性AMD仍然会进展，并且，长时间抗VEGF药物治疗后，黄斑区会发生萎缩[50]。正常情况下，RPE分泌合理量的VEGF-A，这对于维持成年人的脉络膜毛细血管结构非常重要，而长期的VEGF-A抑制会损伤脉络膜毛细血管，并影响RPE功能，从而导致黄斑萎[51]。抗VEGF药物对于RPE及黄斑的副作用与高VEGF-A表达造成RPE功能异常却可以同时发生，长期抗VEGF药物治疗使通过干扰脉络膜毛细血管的生理VEGF-A分泌而导致黄斑萎缩，而高VEGF表达则是通过造成RPE屏障破换影响视黄酸代谢导致RPE功能异常[52]。这就为湿性AMD的治疗提出了新的问题，频繁的抗VEGF药物使用有时会起到反作用。

四、小结

多种细胞因子参与了RPE分泌VEGF-A的调节，适量的VEGF表达对于眼部的结构完整和稳态维持至关重要，而当体内外环境因各种刺激受到影响时，此种平衡遭到破坏，AMD就会应运而生。目前抗VEGF药物已广泛应用于湿性AMD的治疗，但如何使局部过度表达的VEGF-A下调至正常水平并保持稳定，而不是使之一味下调，最终导致RPE功能受损，是我们面临的新挑战。未来，如果能开发新型生物活性制剂选择性调整眼内VEGF水平，使之高降低升，或许对于湿性乃至干性AMD的治疗取得意想不到的成效。