miR-150、Beclin-1 及ELOVL6在原发性痛风患者外周血单个核细胞中的表达及与病情的关系研究

郑 冰，顾维杰，汪 池，吴旭强

(成都市第五人民医院，四川 成都 611130)

痛风是由于嘌呤代谢紊乱，血液中尿酸(UA)生成过多以及排泄减少，尿酸盐结晶在关节滑膜、软骨、滑囊或其他组织中沉积而引起的反复发作性炎性疾病[1]。随着饮食结构及生活习惯的改变，痛风发病率为逐年上升趋势，探究原发性痛风发病机制，对患者的预防及治疗有积极意义。有研究认为微小RNA可能参与机体的代谢性疾病、自身免疫疾病、炎性疾病等，在痛风的发生、发展中也扮演着重要的角色，但其机制还需进一步研究[2]。Beclin-1是酵母自噬相关基因6中的同系物，有研究显示，自噬通过直接或间接影响炎性体，对白细胞介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)具有限制作用，并与痛风炎症反应有直接的联系[3]。ELOVL6为ELOVL家族中的一员，可表达于肝、脑、肾上腺等组织中，有研究发现，ELOVL6可参与胰岛素敏感性的调节，对TOLL样受体、NLRP3等炎性因子、炎性细胞可具有直接或间接的调节作用[4]。基于此，本文通过分析miR-150、Beclin-1 及ELOVL6在原发性痛风患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中的表达情况，并探讨三者与患者病情之间的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集本院2018年3月至2021年5月我院收治的原发性痛风患者98例(GA组)，纳入标准：①符合美国风湿病学会中有关原发性痛风的诊断标准[5]；②患者家属均知晓并同意本次研究，已签署知情同意书；③临床资料完整。排除标准：①有痛风石形成；②合并存在尿酸盐肾病、尿酸性尿路结石者；③存在内分泌、心、肝、肾等系统存在严重疾病者；④近期3个月内有使用激素药物治疗者；⑤为继发性痛风者。98例患者中男67例，女31例，年龄为30～74岁[(51.26±4.15)岁]，病程1～10年[(5.14±2.33)年]。并根据患者临床症状分为急性期(AGA组)47例与非急性期(NAGA组)51例，AGA组中男33例，女14例，年龄30～74岁[(50.33±3.61)岁]，病程1～10年[(5.35±1.64)年]；NAGA组中男34例，女17例，年龄30～74岁[(51.11±3.59)岁]，病程1～10年[(4.93±1.73)年]，两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。另选取本院同期健康体检志愿者84例(对照组)，身体健康，无痛风史、感染史、心血管疾病者，实验室检查均正常，其中男55例，女29例，年龄30～75岁[(51.54±4.61)岁]，GA组与对照组在性别、年龄等一般资料上比较差异无统计学意义，具有可比性(P>0.05)。本研究通过医院伦理委员会批准。

1.2 方法①miR-150、Beclin-1 及ELOVL6检测方法：患者均在入院后次日清晨空腹抽取静脉血液3 ml，对照组则在体检当日清晨空腹抽取静脉血液3 ml，使用人淋巴细胞分离液无菌分离出PBMC，分离液由天津灏洋生物公司提供。miR-150、Beclin-1 及ELOVL6均使用Western blotting 技术检测。将所获PBMC行SDS-PAGE 电泳分离后转膜封闭，使用CST公司提供的兔抗人miR-150、Beclin-1 及ELOVL6(1∶1000)、北京康为世纪生物科技有限公司提供GAPDH(1∶1000)，二抗为京中杉金桥生物技术有限公司提供分山羊抗兔IgG(1∶3 000)，进行孵育，随后通过洗膜、ECL显色后使用相关软件进行分析，以GAPDH为内参，所得miR-150、Beclin-1 、ELOVL6 灰度值 /GAPDH 灰度值作为miR-150、Beclin-1 及ELOVL6蛋白相对表达量。②UA检测：入选者与清晨空腹抽取静脉血液3 ml，获取患者血液标本，使用离心机离心后使用DxC800全自动生化仪分析UA，试剂由齐一生物科技(上海)有限公司提供。

1.3 观察指标①对比不同人群中miR-150、Beclin-1 、ELOVL6、UA表达情况；②对比AGA、NAGA组miR-150、Beclin-1 、ELOVL6、UA表达情况及视觉模拟评分(visual analogue scale，VAS)。在入院时均使用VAS评估患者疼痛情况，得分越高代表患者疼痛情况越严重[6]。③分析miR-150、Beclin-1 及ELOVL6与UA、VAS评分相关性。

1.4 统计学方法采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；计数资料以n(%)表示，采用χ2检验；相关性分析采用Pearson检验分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同人群miR-150、Beclin-1 、ELOVL6、UA表达情况比较GA组miR-150、Beclin-1 、ELOVL6蛋白表达均明显低于对照组，UA表达则明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 AGA组与NAGA组miR-150、Beclin-1 、ELOVL6、UA表达情况及VAS评分比较AGA组患者miR-150、Beclin-1 、ELOVL6表达低于NAGA组，UA、VAS评分高于NAGA组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3 miR-150、Beclin-1 及ELOVL6与UA、VAS评分相关性分析miR-150、Beclin-1 及ELOVL6与UA、VAS评分之间均为负相关(P<0.05)。见表3。

表1 不同人群miR-150、Beclin-1 、ELOVL6、UA表达情况比较

表2 AGA组与NAGA组miR-150、Beclin-1 、ELOVL6、UA表达情况及VAS评分比较

表3 miR-150、Beclin-1 及ELOVL6与UA、VAS评分相关性分析

3 讨论

Beclin-1是自噬的特异性基因。在以往有研究显示，Beclin-1蛋白表达情况可反应出机体中自噬活性，通过饥饿诱导细胞自噬实验发现，自噬进程十分快速，Beclin-1 蛋白在饥饿诱导后1h表达上调，3h后到达峰值后逐渐降低[7]。也有研究发现，Beclin-1 表达降低说明原发性痛风患者机体中存在自噬异常激活，并可通过自噬溶酶体途径进行降解[8]。在本研究中发现原发性痛风患者其体内Beclin-1蛋白表达明显低于对照组，且随着患者病情进展为逐渐降低趋势，Beclin-1蛋白异常表达提示原发性痛风患者体内自噬异常，Beclin-1蛋白与原发性痛风发生、发展间存在一定联系。

miRNA通过转录后水平在机体中发挥着作用，参与细胞分化、增殖、发育应答过程[9]。多项研究中均提示，miRNA可通过和TLRs、NLRP3、NF-κB等靶点进行结合，从而参与痛风炎症的发生、发展[10]。有研究发现，miR-150在痛风患者与骨关节炎患者的PBMC中的表达，明显低于健康人群。与本研究结果相符，且在本研究中，AGA组miR-150低于NAGA组，与以往研究结果相符，提示miR-150可能参与痛风炎症反应的发生，其表达水平则与炎症的严重程度密切相关[11]。在Shi等[12]研究中也发现，miR-150表达水平与痛风患者急性期的白细胞、中性粒细胞之间为负相关，与慢性患者的炎症指标则为正相关。

在以往有动物实验证明，ELOVL6(-/-)鼠对SREBP-1、过氧化物酶体增殖物活化受体下游的脂代谢基因表达有抑制作用，从而改变细胞内脂肪酸成分，有利于恢复胰岛素受体(IRS-2)的敏感性；同时对肝蛋白激酶Cε具有抑制作用，恢复IRS-1、2络氨酸激酶磷酸化，并维持IRS-1、2功能，降低机体胰岛素抵抗[13]。有研究显示，原发性痛风患者具有明显代谢紊乱及胰岛素抵抗现象，ELOVL6可改变细胞内脂质、稳定机体能量，对胰岛素受体敏感性有调节作用，从而参与了胰岛素抵抗与原发性痛风发病过程[14]。在本研究中GA组ELOVL6蛋白表达低于对照组，且随着GA组患者病情加重ELOVL6的表达也更低。

在临床中发现，血液中UA浓度与痛风之间关系密切，UA浓度升高者其痛风发生概率明显升高。如果大量的尿酸盐在患者的关节及周围的组织中大量的沉积，一旦受到外界环境改变或创伤触发，可导致晶体大量的被释放到关节腔间隙，炎性细胞则可在局部大量聚集，导致痛风急性发作[15]。VAS评分则是临床中评估患者疼痛的有效指标，得分越高代表患者疼痛更严重。在本研究中miR-150、Beclin-1 及ELOVL6与UA、VAS评分之间均为负相关，进一步支持miR-150、Beclin-1 及ELOVL6表达异常在痛风发展过程中可能发挥重要作用，随着患者病情进展，三者表达也明显降低。

综上所述，miR-150、Beclin-1 及ELOVL6在原发性痛风患者PBMC中的表达均下调，与患者病情关系密切。临床中可以三者作为相关潜在靶基因研究，为临床靶向治疗原发性痛风提供新方向。