生长激素释放肽基因多态性与青春期前特发矮小患儿重组人生长激素治疗疗效的关系研究

雷巧容，李自尊，宋芬芳，石海燕，李 科

(邵阳学院附属第一医院儿童康复保健科，湖南 邵阳 422000)

特发性矮小属于多基因遗传病，是一种暂时性、原因不明的身材矮小症[1]。可能是由于病理或者生理等多种原因引起的身材矮小。诊断标准主要是特发性矮小症孩子的身高低于相同同种族、地区、性别、年龄正常标准参考范围平均值两个标准差[2]。关于特发性矮小症材致病机理至今尚未阐明，但皮下注射重组人生长激素(rhGH)是治疗特发性矮小公认的方法。rhGH是采用DNA重组技术合成的激素类物质[3]，能够促进脂肪组织分解、合成代谢、肝糖原分解及骨骺软骨细胞增殖合成基质[4]，所以除了治疗各类矮小症外，还广泛应用于其他的医学领域。生长激素释放肽(Ghrelin)在外周、中枢神经系统及胃肠道中均匀分布，相关研究证实，Ghrelin可能具有旁分泌和内分泌的作用[5]，Ghrelin在生长激素调节方面起着重要作用[6]。本研究探讨Ghrelin基因多态性与青春期前特发矮小患儿rhGH治疗疗效的相关性，旨在为临床特发矮小的治疗提供指导。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2020年9月1日至2021年12月30日在邵阳学院附属第一医院儿童保健科门诊诊治的特发性矮小症儿童及青少年48例作为研究组，纳入标准：①年龄8～14岁；②符合《矮身材儿童诊断指南》的诊断标准；③身高低于本种族、同年龄以及同性别正常健康儿童身高第3百分位数或2个标准差以上；④生长速率(GV)≤5 cm/年；⑤生长激素激发试验结果测定生长激素(Growth hormone ,GH)峰值≥10 μg/L。排除标准：①遗传代谢病，GH缺乏症等引起的矮小；②器质性疾病患儿；③严重的肝、脏、肾器官异常或恶性肿瘤患儿。选取本院同期体检健康儿童48例为对照组。本研究在通过伦理委员会审核后实施，所有患者监护人签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1治疗方式 对照组不予任何干预，研究组48例受试儿童注射重组人生长激素治疗，治疗效果具有剂量依赖性应存在个体差异，参考我国《基因重组人生长激素儿科临床规范应用的建议》[7]，治疗建议中rhGH治疗应采用个体化治疗，宜从小剂量开始，在治疗过程中，宜根据生长情况以及生化检测结果等适时进行剂量调整。重组人生长激素注射液(长春金赛药业有限责任公司，国药准字：S20050024)剂量为0.125～0.20 IU/(kg·d)，每天1次，临睡前半小时皮下注射，每天1次，连续干预1年。

1.2.2基因测序 治疗前和治疗后1年采集受试儿童的静脉血2 ml，乙二胺四乙酸抗凝，利用血液试剂盒提取基因组DNA,收集所得DNA溶液,进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)，根据实验设计引物,通过PCR反应分别扩增rs696217和rs26312位点 SNP的片段。设计的引物分别为rs696217上游引物：AGCAAACACGCTATTACGT，下游引物：TCACACGGACAGGCTCCAAG；rs26312-上游引物：TGGAATGGTCGTATATGAG；下游引物：CATGATTACGGCATTAGCGCA；PCR扩增总反应体系为 20 μl，符合PCR扩增的条件，进行PCR 产物纯化，变性，用ABI 3500DX测序仪进行测序，验证PCR扩增产物未预期的目的基因片段。

1.3 观察指标①收集两组受试儿童的临床资料，包括年龄、身高、体重、骨龄年龄差(BAD)、骨龄指数(BAI)、血清生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)水平；②对比Ghrelin基因rs696217和rs26312位点不同基因型的生长速率；③分析Ghrelin基因rs696217和rs26312位点不同基因型与特发矮小的相关性；④对比特发矮小治疗前和治疗1年后临床相关指标，包括年龄、生长速率(GV)、年龄对应身高标准差积分(HtSDSca)、骨龄对应身高标准差积分(HtSDSba)、IGFBP-3和IGF-1水平。

1.4 统计学方法应用SPSS 23.0统计学软件处理数据。计数资料用例数(%)表示，组间比较行χ2检验；符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；不符合正态分布的计量资料用M(Q1，Q3)表示，比较采用秩和检验；Logistic 回归分析发生特发矮小的危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组儿童临床资料比较两组儿童年龄比较差异无统计学意义，具有可比性(P>0.05)；特发矮小组的身高、体重、BAI、BAD、IGF-1和IGFBP-3水平均明显低于对照组，差异有统计学意义 (P<0.05)。见表1。

表1 两组儿童临床资料比较

2.2 Ghrelin基因rs696217和rs26312位点多态性分析对照组和特发矮小组Ghrelin基因rs696217位点有G和T两种基因，三种基因型GG、GT和TT，见图1a；对照组和特发矮小组Ghrelin基因rs26312位点有C和T两种基因，三种基因型CC、CT和TT，见图1b。

2.3 Ghrelin基因rs696217和rs26312位点的基因分布对照组和特发矮小组rs696217位点和rs26312位点基因分布情况比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.4 两组治疗前生长速率基本情况比较特发矮小组中Ghrelin基因rs696217和rs26312位点不同基因型的GV明显低于对照组 (P<0.05)，见表3。

图1 Ghrelin基因rs696217和rs26312位点多态性切割位点 a：1、3、11:rs696217位点GG；5、6、7、8、9:rs696217位点GT；4、10、12、13、15:rs696217位点TT ；b:1、8、9、11、13：rs26312位点TT;4、5、7、12：rs26312位点CT;2、3、6、10、14 ：rs26312位点CC

表2 Ghrelin基因rs696217和rs26312位点的基因分布频次

表3 Ghrelin基因rs696217和rs26312位点治疗前GV比较 (cm/年)

2.5 Ghrelin基因rs696217和rs26312位点不同基因型与特发矮小的关系分析以rs696217和rs26312不同基因型为自变量，Logistic 回归分析显示，rs696217位点中GT、TT基因型是特发矮小患病的影响因素(P<0.05)。见表4。

表4 Ghrelin基因rs696217和rs26312位点不同基因型与特发矮小的关系分析

2.6 特发矮小患儿治疗后临床指标比较治疗前，特发矮小组患儿Ghrelin rs696217和rs26312各基因型中年龄、GV、HtSDSca、HtSDSb、IGFBP-3和IGF-1水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后,特发矮小组患儿Ghrelin rs696217基因型GG型中GV、IGFBP-3和IGF-1水平明显高于GT型和TT型(P<0.05)，而HtSDSca、HtSDSb差异无统计学意义(P>0.05)；特发矮小组患儿Ghrelinrs26312各基因型中GV、HtSDSca、HtSDSb、IGFBP-3和IGF-1水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 特发矮小患儿Ghrelin基因rs696217和rs26312位点治疗后临床相关指标比较

3 讨论

目前矮小症的发病率高达30%以上[8]，其中遗传因素作为影响身高最主要的因素，约占70%以上，对儿童的心理能力和社会适应能力产生了严重的影响[9]。GH是一种肽类激素，是人类促生长的最主要激素[10]，而Ghrelin是调节GH分泌的内源性物质，不但具有内分泌的作用，而且还能够增强胃肠蠕动和促进食欲[11]。Akalu等研究提示，Ghrelin能够快速的刺激GH分泌，且该生理作用具有一定的依赖性[12]。目前关于Ghrelin基因多态性在GHD患儿心脏病变[13]等疾病中出现过相关报道，但关于Ghrelin基因多态性在特发性矮小患儿的相关报道较少，所以本研究主要探讨Ghrelin基因多态性rs696217和rs26312位点与青春期前特发矮小患儿rhGH治疗疗效的相关性，为指导青春期前特发矮小个性化治疗提供理论依据。

特发矮小需要及时干预，以防低于遗传的靶身高。随着rhGH激素的批量生产，rhGH在国内得到广泛应用，大量的研究表明，特发矮小接受rhGH治疗取得了较好的疗效，而且rhGH治疗不良反应较少，安全有效，对改善了特发矮小的生长率疗效确切[14]。rhGH是重组DNA技术而获得的激素类物质，和内源性GH的作用相同。步佳霖等研究表明，rhGH治疗矮小症患儿的临床疗效显著，且与改善骨代谢具有一定的关系[15]。

rs696217(Leu72Met)位于Ghrelin基因的第二外显子区域，由G→T，此突变导致亮氨酸变成甲硫氨酸[16]。rs26312(-994C/T)位于启动子区域，由C→T，此突变导致在前驱蛋白羧基端的精氨酸变为谷氨酰胺[17]。相关研究表明，rs696217位点在代谢综合征及肥胖等疾病中都有相关报道[18]。通过临床资料对比发现，特发矮小组的身高、体重、BAI、BAD、IGF-1和IGFBP-3水平明显低于对照组，紧接着对Ghrelin基因rs696217和rs26312位点多态性进行分析,发现rs696217位点有G和T两种基因,三种基因型GG、GT和TT；而rs26312位点有C和T两种基因，三种基因型CC、CT和TT，且对照组和特发矮小组rs696217位点和rs26312位点基因分布情况对比无显著性差异。又继续验证了rs696217和rs26312位点不同基因的生长速率，结果发现，特发矮小组中Ghrelin基因rs696217和rs26312位点不同基因型的生长速率明显低于对照组，且rs696217位点中GT、TT基因型可能是特发矮小患儿患病的影响因素,而rs26312位点不同基因型可能不构成对特发矮小的患病影响因素。最后对治疗前和治疗1年后的临床指标进行对比，结果发现，治疗前，特发矮小组患儿rs696217和rs26312各基因型的相关指标无明显变化，治疗后，特发矮小组患儿rs696217 GG型中GV明显高于GT、TT型，IGF-1和IGFBP-3水平也明显高于GT、TT型，而其他指标以及rs26312位点各基因型指标对比无明显差异。从而说明rs26312位点GT、TT型可能对特发性矮小发病和rhGH治疗有一定的影响。相关研究表明，儿童特发性矮小症患儿应用rhGH治疗效果满意，可明显改善特发性矮小症患儿体内血清Ghrelin及IGF-1水平,安全无副作用,促进患儿健康成长[19]。胡玲等研究表示，rHGH联合常规治疗可更有效地治疗小儿特发性矮小症，其机制可能与rHGH具有调节Ghrelin、IGF-1 水平,从而提高代谢并促进细胞生长有关[20]。

综上，Ghrelin基因rs696217位点GT、TT型与特发性矮小发病及rhGH的疗效可能存在一定的关系，对临床rhGH治疗青春期前特发矮小具有一定的指导意义。本研究存在一定的不足，由于样本量有限,纳入的样本较少,需要扩大样本量进行继续验证Ghrelin基因rs696217和rs26312位点和青春期特发矮小患儿rhGH治疗的关系，为疾病的预防提供一定的理论基础。