饲粮中性洗涤纤维水平对黑藏羊肌纤维类型组成比例与肉质特性的影响

周力，王志有，杨葆春，侯生珍，张峰硕，桂林生*

（1.青海大学农牧学院，青海 西宁 810016；2.宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021）

肌纤维是构成肌肉组织的基本结构单位，其类型组成与动物的产肉量以及肉质性状密切相关［1］。根据肌球蛋白重链（myosin heavy chains，MyHCs）可以将其划分为4种类型，即慢速氧化型（Ⅰ型）、快速氧化型（Ⅱa型）、中间型（Ⅱx型）和快速酵解型（Ⅱb型）［2］。据相关报道，不同肌纤维的类型代表不同的代谢活性，由Ⅰ型到Ⅱb型表示酵解能力越来越强，氧化能力逐渐减弱［3］。虽然肌纤维的数目是先天性遗传固定的，但肌纤维类型之间却可以相互转化。近年来，通过调整反刍动物饲粮中营养物质摄入量来改善肌肉品质已经成为食品领域研究的热点。

羊肉品质主要受品种、年龄、性别、环境及添加剂等多种因素制约［4］，而饲粮营养水平也是一个重要的方面。研究表明，不同非纤维性碳水化合物（non-fiber carbohydrates，NFC）与中性洗涤纤维比例（neutral detergent fiber，NDF）饲粮下母羊肉中营养成分、氨基酸和脂肪酸的含量具有一定的差异，其比值为0.92时改善羊肉品质效果较好［5］。以母羊为研究对象，同样发现适宜的非纤维性碳水化合物/中性洗涤纤维水平饲粮能够使其肌肉中氧化型肌纤维类型的数量增多，并有效增强抗氧化能力，从而改善羊肉品质［6］。郎玉苗等［7］研究表明肌纤维特性能够影响西门塔尔牛肉质，特别是牛肉的质构特性，且提高Ⅰ型纤维比例和降低Ⅱb型纤维比例均能改善肌肉嫩度。此外，在苏尼特羊也进一步证实，背最长肌中肌球蛋白重链基因表达量与ATP酶组织化学染色法对肌纤维的分型结果基本一致［8］。由此可以看出，反刍动物肉质特性与其饲粮组成、肌纤维类型以及肌球蛋白重链基因的表达量具有一定的联系。黑藏羊作为青藏高原地区藏羊品种中一个特殊的经济类型，以产黑紫羔二毛皮而驰名，已经成为国家地理标志产品，其肉质以细嫩多汁，富含氨基酸、微量元素以及多不饱和脂肪酸等特点而深受广大消费者的喜爱。然而青海畜牧业受草原面积和生态环境的制约，饲养模式逐步由放牧转为舍饲、半舍饲，因此实现生长期黑藏羊合理的营养调节对于发展我国肉羊产业具有重要的意义。

基于此，本试验拟以青海贵南黑藏羊为研究对象，采用ATP酶染色和肌球蛋白重链基因的mRNA表达水平对肌纤维进行分型，同时测定与其肉质性状紧密相关的食用品质与抗氧化能力，旨在通过改变营养水平来改善羊肉品质，为青海省绵羊培育改良提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验方法

试验于2021年2-6月在青海省海南州贵南县黑藏羊繁育中心进行，全期试验共计128 d，其中预饲期为8 d，正试期为120 d。选取发育健康且体重相近［（10.28±0.43）kg］的2月龄黑藏羊公羔40只，随机分为2组，每组20只，每组5个重复，每个重复4只羊，分别饲喂NDF为26.33%（L组）和46.14%（H组）的饲粮。饲养期间每天08：00和17：30各饲喂1次，饮水自由、采食自由。饲粮设计参考中国《肉羊饲养标准》（NY-T 816-2004）［9］进行，粗饲料由燕麦（Avena sativa）青贮和燕麦青干草按干物质1∶1组成，饲粮组成及营养水平见表1。试验前对羊只进行驱虫、防疫、定期消毒，并保持圈舍的干净，其他按照养殖场的规定严格执行。

表1 基础饲粮组成及营养水平Table 1 Basal diet composition and nutrient

1.2 样品采集与处理

试验结束时，分别从L组［平均体重（33.43±1.92）kg］和H组［平均体重（28.80±1.44）kg］各选取5只试验羊按照颈静脉放血方式进行屠宰（禁食12 h，禁水2 h），然后迅速采集每只羊左侧胴体第12～13肋骨间背最长肌作为试验材料，剔除表面筋膜和脂肪，根据不同试验要求分别进行贮藏保存。

1.3 体尺指数计算

在试验结束晨饲前分别测量黑藏羊体斜长、体高、胸围。同时计算体躯指数、体长指数和胸围指数。测量试验羊耆甲最高点到地面的垂直距离作为体高（cm）；测量试验羊肩胛后端围绕胸部1圈的长度作为胸围（cm）；测量试验羊肩胛前端到坐骨结节后端的直线距离作为体斜长（cm）。相关公式如下所示：

1.4 肌纤维组织学特性分析

1.4.1 切片制片与染色 首先将样品沿着肌纤维的方向，切成0.5 cm×0.5 cm×1 cm肉块，置于预冷的异戊烷中脱水干燥30 s，再经液氮速冻，制片时将肌肉块放入-25℃切片机内切片，厚度约5～8 μm，再利用ATP酶组织化学法对黑藏羊的背最长肌进行染色［10］。

1.4.2 肌纤维各项指标测定 应用Eclipse Ci-L显微镜（NIKON，日本）在20×10倍下观察染好的切片，同时运用Image-Pro plus 6.0软件分析肌纤维的直径、横截面积、密度、数量比例和面积比例等指标。每个样本制作3张切片，每张片子随机选择3～4个清晰完整的视野进行拍照，使观察肌纤维总数大于1500根。测量每根肌纤维横截面上最长两点距离和最短两点距离，计算两者的平均值即为肌纤维直径。直接测量并记录每个视野内肌纤维的横截面积，测多根取其平均值作为肌纤维横截面积。统计肌纤维数量，求平均值后换算成每mm2的肌纤维根数，作为被测肌纤维密度。计算每种类型肌纤维的数量，用每种类型的肌纤维数量除以视野中肌纤维总数作为肌纤维数量比例。统计每种类型肌纤维面积总和，用每种类型肌纤维总面积除以总肌纤维面积作为肌纤维面积比例。

1.4.3 肌球蛋白重链基因的表达量检测 试验羊屠宰后，迅速采集左侧胴体第12～13肋骨间50～100 mg的肌肉样品，装入无酶冻存管后立即置于液氮中速冻。肌肉总RNA的提取是严格按照RNAsimple Total RNA Kit的说明书进行操作。使用1.0%的琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计Nano Drop 2000（Themo，美国）检测样品RNA的完整性、浓度和纯度。再将提取的RNA按照FastKing RT kit cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，按照SuperReal PreMix Color（SYBR Green）说明书进行实时荧光定量PCR扩增。试验所需目的基因（MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb、MyHCⅡx）和内参基因（β-actin）的引物均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，引物序列及参数如表2所示。

表2 实时定量PCR引物Table 2 Primer sequences used for real-time PCR

1.5 抗氧化指标的检测

肌肉中总抗氧化能力（total antioxygenic capacity，T-AOC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和过氧化氢酶（catalase，CAT）含量均采用江苏酶标生物科技有限公司的试剂盒进行测定，其货号分别为MB-6284A、MB-9321A、MB-9324A、MB-9361A、MB-9363A。10%匀浆液制备：称取1 g肌肉组织，按质量（g）∶体积（mL）=1∶9的比例，加入预冷的生理盐水，在冰水浴条件下进行匀浆，于4℃条件下3500 r·min-1离心15 min，吸取上清液进行测定，-20℃保存备用。

1.6 食用品质的检测

1.6.1 pH 将校准后的数字式酸度计（PHS-3C型，上海坤诚科学仪器有限公司）的金属头直接插入肉样中，待数值稳定后读数，每个样品重复3次，取其平均值。在黑藏羊屠宰后45 min内记录肌肉pH值。

1.6.2 色泽 从肉样上切取2.0 cm2左右的肉块，上面随机选取3个点，使用全自动色差仪（TC-P2A型，上海精密仪器仪表有限公司）测定，结果以亮度值（L*值）、红度值（a*值）和黄度值（b*值）来表示。

1.6.3 剪切力 切取3 cm×2 cm×2 cm的肌肉块放入蒸煮袋中，经水浴锅85℃熟制，至中心温度达到75℃后维持5 min取出。冷却至室温，再将其切成3 cm×1 cm×1 cm的肉样，采用肌肉嫩度仪（CLM-3型，德国）测定其剪切力值，结果取其3次的平均值。

1.6.4 蒸煮损失 将样品放置蒸煮袋中并记录其蒸煮前质量（m1），然后在75℃水浴中蒸煮，数字温度计测量中心温度，直至达到70℃，保持20 min，解开包装，擦干肌肉表面水分，记录其煮后质量（m2）。蒸煮损失率按公式（4）计算。

1.7 数据统计分析

目的基因的mRNA相对表达量用2-△△Ct法计算，按公式（5）和（6）进行分析［11］。使用Excel 2016软件对原始数据进行统计整理，试验结果以“平均值±标准差（mean±SD）”表示，采用t检验法进行2组间显著性分析，同时利用Graph Pad Prism 7.0软件进行绘图，P＜0.05表示差异显著。

式中：Ct1表示处理组的目的基因循环阈值；Ct2表示处理组的内参基因循环阈值；Ct3表示未处理组的目的基因循环阈值；Ct4表示未处理组的内参基因循环阈值。

2 结果与分析

2.1 不同中性洗涤纤维水平饲粮对育肥期黑藏羊体尺指数的影响

由表3可知，H组体躯指数、体长指数和胸围指数均小于L组，其中体躯指数差异显著（P＜0.05）。由此表明，随着饲粮中性洗涤纤维水平的提高，黑藏羊体躯指数、体长指数和胸围指数呈下降趋势。

表3 不同NDF饲粮对黑藏羊体尺指数的影响Table 3 Effects of different NDF diets on body size index of black Tibetan sheep（%）

2.2 不同中性洗涤纤维水平饲粮对育肥期黑藏羊肌纤维特性的影响

2.2.1 黑藏羊背最长肌ATP酶染色结果 试验采用ATP酶组织染色法对不同NDF水平饲粮下黑藏羊的背最长肌进行染色，在20×10倍的显微镜下进行观察，标尺为100 μm，结果如图1所示。经ATP酶染色后肌纤维主要分为3种类型，颜色最深的均是Ⅰ型肌纤维，颜色最浅的均是Ⅱb型肌纤维，介于两者颜色之间的均是Ⅱa型肌纤维。

图1 低（A）和高（B）NDF饲粮下黑藏羊背最长肌ATP酶染色Fig.1 ATPase staining of longissimus dorsi muscle of black Tibetan sheep under low（A）and high（B）NDF diets

2.2.2 不同NDF水平饲粮对黑藏羊肌纤维直径、横截面积和密度的影响 由图2可知，L组黑藏羊背最长肌Ⅰ型、Ⅱa和Ⅱb型肌纤维直径、横截面积均大于H组，但均未达到显著水平（P＞0.05），而Ⅰ型、Ⅱa和Ⅱb型肌纤维密度则呈相反趋势（P＞0.05）。在2种NDF饲粮条件下，黑藏羊肌纤维直径和横截面积总体都为Ⅰ型＜Ⅱa型＜Ⅱb型，而黑藏羊肌纤维密度则为Ⅱb型＜Ⅱa型＜Ⅰ型。

图2 不同NDF饲粮下黑藏羊肌纤维的直径、横截面积和密度Fig.2 Muscle fiber diameter，cross-sectional area and density of black Tibetan sheep in different NDF diets

2.2.3 不同NDF水平饲粮对黑藏羊肌纤维数量比例的影响 由表4可知，黑藏羊背最长肌Ⅰ型、Ⅱa型肌纤维数量比例均为L组小于H组，其中Ⅱa型肌纤维的数量比例存在显著差异（P＜0.05）。而Ⅱb型肌纤维的数量比例则为L组大于H组，但差异不显著（P＞0.05）。在低NDF饲粮条件下，黑藏羊背最长肌氧化型肌纤维（Ⅰ型和Ⅱa型）的数量比例为32.82%，高NDF饲粮黑藏羊背最长肌中氧化型肌纤维的数量比例为41.25%。这说明肌纤维的数量比例受到饲粮中NDF水平的影响较大。

表4 不同NDF饲粮对黑藏羊肌纤维数量比例的影响Table 4 Effects of different NDF diets on the proportion of muscle fiber in black Tibetan sheep（%）

2.2.4 不同NDF水平饲粮对黑藏羊肌纤维面积比例的影响 由表5可知，H组黑藏羊背最长肌Ⅰ型和Ⅱa型肌纤维的面积比例均显著大于L组（P＜0.05）。两种NDF饲粮条件下都以Ⅱb型肌纤维为主，其中L组Ⅱb型肌纤维的面积比例为91.21%，H组Ⅱb型肌纤维的面积比例为86.39%。这表明在低NDF饲粮条件下黑藏羊背最长肌酵解型肌纤维的面积比例与高NDF饲粮条件下相比有所减少。

表5 不同NDF饲粮对黑藏羊肌纤维面积比例的影响Table 5 Effects of different NDF diets on the area of muscle fiber in black Tibetan sheep（%）

2.2.5 不同NDF水平饲粮下黑藏羊肌纤维MyHCs基因表达规律 由图3可知，H组MyHCⅠ基因、MyHCⅡa基因的mRNA相对表达量均显著大于L组（P＜0.05）。而H组MyHCⅡb基因、MyHCⅡx基因mRNA相对表达量均显著小于L组（P＜0.05）。由此可知，青海黑藏羊MyHCs基因的表达量受饲粮组成的影响较大。

图3 黑藏羊MyHCs基因的表达量Fig.3 Expression of MyHCs genes in black Tibetan sheep

2.3 不同中性洗涤纤维水平饲粮对育肥期黑藏羊肌肉抗氧化功能的影响

与L组相比，H组肌肉超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和总抗氧化能力（T-AOC）分别提高了2.91%、1.07%、9.88%和18.72%，而丙二醛（MDA）含量下降了3.38%，其中总抗氧化能力差异显著（P＜0.05）（表6）。这揭示不同NDF饲粮对黑藏羊肌肉的抗氧化能力具有一定的影响。

表6 不同NDF饲粮对黑藏羊肌肉抗氧化能力的影响Table 6 Effects of different NDF diets on muscle antioxidant capacity of black Tibetan sheep

2.4 不同中性洗涤纤维水平饲粮对育肥期黑藏羊肌肉食用品质的影响

L组肌肉红度（a*）显著低于H组（P＜0.05），而L组肌肉剪切力则显著大于H组（P＜0.05），各组间肌肉pH、亮度（L*）、黄度（b*）和蒸煮损失均差异不显著（P＞0.05）（表7）。这表明不同NDF水平饲粮对黑藏羊肌肉红度（a*）和剪切力的影响较大。

表7 不同NDF饲粮对黑藏羊肌肉食用品质的影响Table 7 Effects of different NDF diets on muscle dietary quality of black Tibetan sheep

3 讨论

3.1 不同中性洗涤纤维饲粮对育肥期黑藏羊体尺指数的影响

体尺数据能够直接反映反刍动物的体格大小、体躯的结构、发育等状况，也可间接反映畜体组织器官发育的基本情况［12］。体尺指标与家畜生理机能、生长性能、抗病力以及对外界生活条件的适应能力等紧密相关［13］。其中体躯指数反映体量发育程度，体长指数衡量一个阶段体长和体高的相对发育情况，而胸围指数则体现体躯的相对发育情况［14］。由此可见研究体尺性状可为藏羊的选育工作提供一定的理论依据。以秦川牛为研究对象，发现随着年龄的增加，髋胸指数、胸宽指数、胸围指数以及体躯指数在公、母牛上都呈增大趋势［15］。程郁昕等［16］指出，体躯指数能够在一定程度上表明体躯容积的大小，说明奶牛体躯容积大，采食量也大，继而产奶量也就越多。从以上结论可以看出，机体的生长发育与其体尺指数密切相关。本试验发现，H组黑藏羊体躯指数显著小于L组。说明黑藏羊的体躯指数和饲粮中性洗涤纤维水平呈负相关，符合反刍动物生物学的规律。这进一步证实体尺指数能够反映不同体躯部位的相对发育程度，从而反映机体的体态特征及可能的生产性能。

3.2 不同中性洗涤纤维饲粮对育肥期黑藏羊肌纤维特性的影响

不同类型肌纤维具有不同的结构、功能、收缩和代谢特征，因而畜禽屠宰后肉质性状受肌纤维生物学特性的影响较大［17］。此外饲粮组成又是影响肌纤维类型的主要因素。因此，比较不同中性洗涤纤维水平饲粮条件下黑藏羊肌纤维特性的差异，研究不同肌纤维类型来改善羊肉品质显得尤为重要。据相关报道，肌肉中肌纤维类型主要由氧化型（Ⅰ型/Ⅱa型）与酵解型（Ⅱb/Ⅱx）共同组成［18］。当氧化型肌纤维比例高时，肌肉的肌内脂肪含量和pH值较高，肉色较好，并且肌肉系水力较强，细嫩多汁，风味更好，而酵解型肌纤维比例升高时会加快宰后肉中pH值降低速度，造成肌肉滴水损失增加和颜色下降，从而降低肉质［19］。本试验通过ATP酶染色与MyHCs基因的表达量对肌纤维分型，发现与高NDF饲粮相比，低NDF饲粮能够使黑藏羊背最长肌的肌纤维类型由酵解型向氧化型转化。肌纤维类型组成的差异是影响肉质特性的重要因素［20］。在大鼠中的研究表明，酵解型肌纤维含量高会使肉的保水性能下降，从而不利于改善肉质［21］。在夏洛来幼牛上亦发现，当肌肉中Ⅱb型肌纤维比例越高时，其剪切力就越大，肉的嫩度则越差［22］。其他试验也进一步证实，Ⅱb型肌纤维直径与猪眼肌面积呈正相关，但与嫩度呈负相关［23］。以上研究均说明当肌肉中酵解型纤维所占比例较高时不利于提高肉质。而本试验得出低NDF饲粮条件下可以降低酵解型纤维的比例。由此可见，饲粮中NDF水平的变化会影响肌纤维类型的改变，进而影响肉质。此外本试验通过RT-qPCR技术对MyHCs基因的表达水平进行检测，结果发现H组MyHCⅠ、MyHCⅡa基因的表达量显著大于L组，而MyHCⅡb、MyHCⅡx基因的表达量则相反。这也从分子水平验证了肌纤维类型组成与其肌球蛋白重链基因的mRNA相对表达量具有一定的关联。

3.3 不同中性洗涤纤维饲粮对育肥期黑藏羊肌肉抗氧化功能的影响

在正常生理状态下，机体自身氧化与抗氧化系统处于动态平衡，当受到外界应激时，体内会产生大量自由基，造成氧化损伤，从而影响机体的健康状况［24］。研究发现，肌肉氧化稳定性不仅与肉的颜色、嫩度和风味等关系密切，还可能和有毒物质的形成紧密关联［25］。因此，通过测定肌肉抗氧化能力能够衡量动物某一阶段抵抗刺激、疾病等的能力，同时可间接反映机体生长发育状况［26］。抗氧化系统可分为非酶类和酶类系统，其中酶类系统主要由超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶组成，可以增强机体的防御和免疫能力，减少氧化损伤程度［27］。从本试验来看，H组肌肉超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶含量均高于L组。其原因可能是L组饲粮中NDF含量较低，相应饲料中精料量就较高，过多的精料量会造成体内细胞和瘤胃内环境与微生物代谢发生异常，造成体内自由基数量不断蓄积，继而引发氧化应激的产生。总抗氧化能力是衡量机体抗氧化能力的标志，代表抗氧化能力的综合水平［28］。丙二醛通常可反映机体内脂质过氧化的程度，能够间接地反映出细胞损伤的程度［29］。在本试验中，与高NDF饲粮相比，低NDF饲粮条件下肌肉总抗氧化能力含量明显提高，而丙二醛含量略微下降，说明此时机体代谢处于一种较为稳定的状态，抗氧化能力也较强，这也进一步解释了为什么高精料饲粮下动物容易发生一系列疾病［30］。在西藏牦牛上同样发现，相较于高精料饲粮（精粗比60∶40），低精料饲粮（精粗比40∶60）更有利于提高营养物质消化吸收，促进机体蛋白质代谢，并且能增强抗氧化能力［31］。其他试验同样证实，饲粮中营养物质的缺乏和不平衡均可导致机体发生氧化应激［32］。提示在今后藏羊日常饲养管理中，选择合适的营养水平饲粮十分重要。

3.4 不同中性洗涤纤维饲粮对育肥期黑藏羊肌肉食用品质的影响

pH是反映宰后肌糖原酵解代谢速率的指标，是衡量肉质好坏的重要因素［33］。动物刚屠宰时正常肌肉中pH值为6～7，随后缓慢下降至5.6左右［34］。而本试验得出黑藏羊屠宰后羊肉pH值为6.02～6.26，符合鲜肉pH值标准。肉色是用来评价肉新鲜度的重要指标，直接影响消费者的直观感受和购买欲望［35］。在肉色评价中，一般认为亮度值（L*）和黄度值（b*）越低，红度值（a*）越高，表明肉色就越好［36］。从试验结果来看，H组肌肉L*值、b*值均小于L组，但H组a*值却明显大于L组。表明在一定范围内，增加饲粮NDF比例能够改善肌肉的肉色。嫩度通常用剪切力来表示，其数值越高，说明肌肉韧性较强，反之则表示嫩度越好，口感较佳［37］。本试验中，H组剪切力明显小于L组，推测其原因可能是：首先，随着羔羊肌纤维直径和横截面积的增大，剪切力随之增大，嫩度则降低［38］，其次，高NDF饲粮下，羔羊胴体重较轻，皮下脂肪蓄积较少，体温下降较快，发生肌肉收缩，从而降低剪切力。蒸煮损失可反映肌肉烹调过程中水分损失的程度。一般认为肌肉的蒸煮损失越小，熟肉率越高，肉的保水性能也就越好，表明肉品质就越佳。以贵州地区绵羊、山羊为研究对象，郭娉婷等［39］发现，补饲对羊肉的蒸煮损失无显著影响。施安等［40］研究进一步表明，不同蛋白营养水平精补料对黄渠桥羊的熟肉率无显著影响。本试验结果与上述研究结论相一致。由此可知，不同营养水平的饲粮对黑藏羊肌肉蒸煮损失未产生明显的影响。

4 结论

在本试验条件下，与低NDF饲粮相比，高NDF饲粮有利于增加生长期黑藏羊肌肉中氧化型肌纤维的数量比例，同时提高其抗氧化能力，并有效改善羊肉品质。