纤维素酶辅助提取陕产珠子参多糖工艺及抗氧化活性研究 *

贺维涛 赵重博 年婧

(1.泾阳县医院，陕西 咸阳 713700；2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；3.陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712000)

珠子参为五加科植物珠子参PanaxjaponicasC.A.Mey.var.major (Buck.) C.Y.Wu et K.M.Feng或羽叶三七PanaxjaponicusC.A.Mey.var bipinnatifidus (Seem.)C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥根茎，主产云南、陕西、四川等地，陕产珠子参也是陕西太白七药里的八大金刚之一——纽子七，具有补肺养阴，祛瘀止痛，止血，抗肺纤维化的功效[1-2]。研究报道珠子参多糖PJPS1-A对血虚模型小鼠的造血功能有很好的保护作用[3]，同时体外研究表明珠子参多糖对肝癌[4-5]、胃癌[6]、抗补体活性[7]和衰老[8]也有一定的功效，而抗氧化活性与癌症和衰老密切相关，因而研究其提取工艺和抗氧化活性更加重要。

植物根茎类组织一般富含较多的纤维素，因此使用纤维素酶提高该类中药多糖的得率是常用的方式[9]。之前已有应用正交设计研究超声提取和水提醇沉法制备珠子参多糖的工艺研究，因此选用水作为提取溶剂[10-11]，在单因素实验基础上，采用正交试验设计优化珠子参多糖提取工艺并对其抗氧化活性进行研究，以期为珠子参的开发应用提供依据和参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 Autoscience AS 5150A超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；电热式恒温水浴锅(江苏金坛宏凯仪器厂)；RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；LXJ-Ⅱ离心沉淀机(上海医用分析仪器厂)；UPT-11-10T优普系列超纯水器 (成都超纯科技有限公司)；DB-206SC电热鼓风恒温干燥箱(成都天宇试验设备有限责任公司)；Scientz-10N型真空冷冻干燥机(宁波新艺生物科技股份有限公司)；FA2004N型电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；METTLER TOLEDO十万分之一天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2试药 珠子参药材，购于陕西眉县，经陕西中医药大学王昌利教授鉴定为珠子参PanaxjaponicusC.A.Mey.v ar.major(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥根茎；D-无水葡萄糖对照品(纯度≥99.5%，批号：140974-110833，中国食品药品检定研究所)；浓硫酸、苯酚、乙醇等均为分析纯；纤维素酶(10 000 U·g-1，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；Vc标准对照品(纯度≥99%，批号：S05J6G1，上海源叶生物科技有限公司)；DPPH标准对照品(Diybio生物科技有限公司)；实验用水为纯化水。

2 方法与结果

2.1珠子参多糖的含量测定

2.1.1供试品溶液的制备 称取珠子参药材粗粉(过2号筛)约1000 g，置于圆底烧瓶中，加入5倍量乙酸乙酯12 h脱脂，过滤，残渣挥干乙酸乙酯后充分干燥，即得脱脂的珠子参药材。精密称取脱脂的珠子参药材50 g，加水500 mL，加纤维素酶4%，在50 ℃下超声(200 W)20 min，过滤，滤液浓缩至100 mL后加95%乙醇至含醇量80%，4 ℃静置过夜后抽滤，残渣用乙醚和无水乙醇抽滤脱色后冷冻干燥，即得珠子参多糖，称定重量，记做M(g)。

精密称取珠子参多糖10 mg至100 mL容量瓶中，加水充分溶解并稀释至刻度即得供试品溶液。

2.1.2线性关系考察 将无水葡萄糖在105 ℃干燥至恒重后，精密称取10 mg加水充分溶解，并定容于100 mL棕色量瓶中，得浓度为0.11 mg·mL-1的葡萄糖对照品溶液。

分别精密吸取葡萄糖对照品溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL 置于10 mL具塞试管中，分别加水至2.0 mL，各加入5.0% 苯酚溶液1 mL和浓硫酸5 mL，摇匀，置于沸水中水浴15 min，取出置于冷水中冷却至室温，于488 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，得回归方程Y=0.0576X+0.0293(r=0.9990)，表明葡萄糖质量浓度在0.0～13.75 μg·mL-1与吸光度呈良好线性关系。

2.2多糖提取率的测定 采用硫酸-苯酚法测定。精密移取供试品溶液1.0 mL置于10 mL 具塞试管中，加1.0 mL水，用5.0%的苯酚和浓硫酸依次处理显色，测定吸光度值，计算多糖浓度，并按照下列公式计算珠子参多糖提取率。

2.3单因素试验考察

2.3.1加水量 称取5份脱脂珠子参药材，每份约10 g，分别加入5、10、15、20、25倍量水，加纤维素酶4%，在50 ℃下超声(200 W)20 min，过滤，滤液醇沉脱色后取10 mg珠子参多糖，测定吸光度，计算多糖提取率分别为4.42%、6.23%、6.75%、6.94%、7.12%，加水量15倍后珠子参多糖提取率基本稳定，故选取15倍加水量进一步考察其他因素，结果如图1。

图1 加水量与珠子参多糖提取率的关系

2.3.2纤维素酶用量 称取5份脱脂珠子参药材，每份约10 g，加150 mL水，分别加入1%、2%、3%、4%、5%的纤维素酶，在50 ℃下超声(200 W)20 min，过滤，滤液醇沉脱色后取10 mg珠子参多糖，测定吸光度，计算多糖提取率分别为2.17%、3.42%、5.45%、6.74%、6.38%，选取4%纤维素酶进一步考察其他因素。结果如图2。

图2 纤维素酶与珠子参多糖提取率的关系

2.3.3超声温度 根据纤维素酶的说明，最佳使用温度为45～55 ℃，故称取3份脱脂珠子参药材，每份约10 g，加150 mL水，加入4%的纤维素酶，在40 ℃、50 ℃和55 ℃条件下超声(200 W)20 min，过滤，滤液醇沉脱色后取10 mg珠子参多糖，测定吸光度，计算多糖提取率分别为6.47%、6.76%、6.71%，在规定温度内纤维素酶的活力和珠子参多糖提取率基本稳定，因此固定超声温度50 ℃，考察其他因素对珠子参多糖提取率的影响。结果如图3。

图3 超声温度与珠子参多糖提取率的关系

2.3.4超声功率 称取5份脱脂珠子参药材，每份约10 g，加150 mL水，加入4%的纤维素酶，在50 ℃下超声(100 W、150 W、200 W、250 W、300 W)20 min，过滤，滤液醇沉脱色后取10 mg珠子参多糖，测定吸光度，计算多糖提取率分别为5.84%，8.61%，6.58%，5.47%，4.92%，超声功率的增加在一定范围内促进珠子参多糖的溶出，但功率太大可能会破坏酶的结构导致提取率下降，故选取超声功率150 W进一步考察其他因素。结果如图4。

图4 超声功率与珠子参多糖提取率的关系

2.3.5超声时间 称取5份脱脂珠子参药材，每份约10 g，加150 mL水，加入4%的纤维素酶，在50 ℃下超声(150 W)分别10 min、20 min、30 min、40 min、50 min过滤，滤液醇沉脱色后取10 mg珠子参多糖，测定吸光度，计算多糖提取率分别为4.23%、8.56%、9.84%、10.68%、10.74%，故选取超声时间40 min进一步考察。结果如图5。

图5 超声时间与珠子参多糖提取率的关系

2.4正交试验优选最佳提取工艺 在单因素试验基础上，固定超声温度为50 ℃，选择加水倍量、纤维素酶用量、超声功率和超声时间作为影响因素表见表1，正交设计方案及实验结果见表2。

表1 因素水平表

表2 正交实验设计表与结果

由表3可知，超声时间对珠子参多糖得率影响最大，其次是超声功率，所选水平范围内加水倍量和纤维素酶的用量对珠子参多糖提取率影响不大。根据各因素的极差值R的影响大小，优选的最佳工艺为A3B3C2D3，即脱脂后珠子参药材加20倍量水，加5%纤维素酶，在50 ℃下超声(150 W)50 min。

表3 方差分析结果

2.5提取工艺参数验证 按照正交试验优化后的工艺参数提取3批珠子参多糖，多糖提取率第一次为11.13%，第二次为10.47%，第三次为10.85%，平均提取率为10.81%，多糖提取率较稳定，优化的提取工艺实用可靠。

2.6珠子参多糖抗氧化活性研究 参考文献的方法[12]精密称取DPPH适量，加无水乙醇制成每1 mL含40 μg的溶液，避光保存。分别配制珠子参多糖0.5，1，2，4，8和10 mg·mL-1系列不同浓度水溶液和Vc 0.5，1，2，4，8和10 mg·mL-不同浓度乙醇溶液，各取2 mL，加入DPPH乙醇溶液2 mL，在试管中混合均匀，室温避光反应30 min，在517 nm处平行测定3次吸光度，记做Ai。以无水乙醇或超纯水代替样品溶液，用同样的方法混匀、反应，平行测定3次吸光度，记做A0。根据公式计算不同样品的提取液对DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率=[1-Ai/AO]×100%。结果见图6。

图6 DPPH自由基清除率结果

珠子参多糖浓度在2 mg·mL-1时对DPPH自由基的清除率达到50%以上，且随着珠子参多糖浓度的增强清除能力不断增强，在8 mg·mL-1时对DPPH自由基的清除率可达80%以上，DPPH自由基的清除率最大达84.25%，但其清除自由基能力较等浓度的Vc较弱。

3 讨论

多糖作为一种天然的高分子物质，由于药物体内过程的认识不断更新，也越来越为人们认识到其潜在的活性和研究价值[13-15]。多糖的提取工艺除了传统的热水提取法之外，随着提取设备的不断研发和对多糖性质的不断深入研究，超声波辅助、微波辅助、酶辅助等手段都大大提升了多糖的提取效率[16-18]。多糖含量方面陕产珠子参优于四川和云南等地的珠子参药材[19]。珠子参多糖的分子量分布在103～105之间，单糖组成主要由葡萄糖和半乳糖组成[20-21]。

本研究通过正交试验优化纤维素酶辅助提取珠子参多糖工艺，得到最优工艺参数为脱脂后珠子参药材加20倍量水，加5%纤维素酶，在50 ℃下超声(150 W)50 min，验证试验表明在此条件下，所得珠子参多糖得率为10.81%，结果表明，通过正交试验优化得到的珠子参多糖提取方法稳定可行。通过对DPPH自由基清除率的测定评价了珠子参多糖的体外抗氧化活性，结果珠子参多糖在8 mg·mL-1时对DPPH自由基的清除率就已达到80%以上，具有良好的抗氧化活性，为其合理开发利用提供参考依据。