4株芽孢杆菌及其应用特征数据综述

安依凡，李 斌，张宗锦，杨章明，陈寿明，闫芳芳，安德荣*

(1.西北农林科技大学植物保护学院植物病毒和资源微生物实验室，陕西杨凌 712100；2.中国烟草总公司四川省公司，四川成都 610000；3.四川省烟草公司攀枝花市公司，四川攀枝花 617000)

富集培养微生物的意义主要包括获得相当数量的目标微生物进而制作微生物剂，用以改良土壤生物与防治病害[1]；也包括获得相当数量的微生物代谢产物进而制作化学剂，用以制药[2]、保健品[3]等；还可以包括明确益生元进而制作益生元微生物助剂，用以改善宿主健康[4]。芽孢杆菌是一类能产生内生孢子的细菌，芽孢杆菌形成的孢子具有很强的耐高温、抗干旱特征，现已广泛应用于农业植物保护领域。芽孢杆菌LB液体培养基发酵产物可以作为芽孢杆菌固体粉剂生产过程中的接种剂，也可以作为液体水剂生产过程中的待放大环节。综述西北农林科技大学植物保护学院植物病毒和资源微生物实验室对4株芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌1号、甲基营养型芽孢杆菌lw-6、贝莱斯芽孢杆菌RJW-5-5、解淀粉芽孢杆菌YF-6的研究结果，旨在为其开发利用提供参考。

1 4种芽孢杆菌的发现与应用

1.1 4种芽孢杆菌的发现1835年Ehrenberg发现枯草芽孢杆菌，并将其命名为“Vibriosubtilis”。1872年随着细菌分类系统的建立，Cohn又将其命名为“Bacillussubtilis”。枯草芽孢杆菌隶属于芽孢杆菌科芽孢杆菌属，作为芽孢杆菌科的模式菌株，菌体呈杆状，无荚膜，周生鞭毛能运动，是自然界中广泛存在的革兰氏阳性菌[5]。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)首先由日本学者Fukomoto于1943年发现并提出，他发表了分泌淀粉酶细菌的分离及分布的研究报告，报告指出解淀粉芽孢杆菌可以分泌细菌淀粉酶。英国学者Priest等[6]于1987年证明了Bacillusamyloliquefaciens这一名称的有效性并指出Bacillusamyloliquefaciens的参照菌株为ATCC 23350。

2005年，西班牙科学家Ruiz-García等[7]从西班牙南部马拉加贝莱斯河采集的苦咸水样品中分离得到2个菌株CR-14b和CR-502T，它们能够合成大量的脂肽类物质并产生抗菌活性。Ruiz-García将其命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)并在IJSEM(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology《国际系统与进化微生物学期刊》)上合格发表。

2010年，来自韩国忠北大学和新加坡国立大学的学者Munusamy Madhaiyan从水稻的根际土壤分离出了细菌CBMB205，并观察到它的运动。该细菌革兰氏染色呈阳性，严格需氧，杆状有鞭毛，具内生孢子，在30 ℃、pH 7.0环境下添加600 mmol/L甲醇的AMS营养基培养下它的生长达到最佳。该细菌被鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)[8]。

1.2 4种芽孢杆菌不同菌株的应用枯草芽孢杆菌Y25能够降低百合枯萎病发病率[9]，枯草芽孢杆菌Bv17能够大幅度降低非洲菊根腐病病情指数[10]，枯草芽孢杆菌Bs-15能够较好防治柿树炭疽病[11](微生物剂)；枯草芽孢杆菌8-2可以产出γ-聚谷氨酸[12]，枯草芽孢杆菌M364可以产出抗菌肽Bacillomycin D[13](化学剂)；枯草芽孢杆菌ACCC11025在0.8 mg/mL白术多糖助剂下显著增殖[14]，枯草芽孢杆菌KCTC 2217在低聚果糖(fructooligosaccharide)助剂下可使日本鳗鲡显著增重[15](益生元微生物助剂)。

解淀粉芽孢杆菌CRJ-9能够有效控制辣椒疫病的发生和蔓延[16]，解淀粉芽孢杆菌Ba168能够突出防治棉花黄萎病[17](微生物剂)；解淀粉芽孢杆菌HRH317可以产出抗菌蛋白[18]，解淀粉芽孢杆菌Y11可以产出淀粉酶[19]，解淀粉芽孢杆菌Tu-115可以产出纤维素酶[20](化学剂)。

贝莱斯芽孢杆菌S6能够较好防治番茄早疫病[21]，贝莱斯芽孢杆菌WK1对水稻纹枯病的防治效果稳定(与5%井冈霉素水剂防效相当)[22]，贝莱斯芽孢杆菌TCS001可显著抑制黄瓜灰霉病病斑生长并能显著降低黄瓜白粉病病情指数[23](微生物剂)；贝莱斯芽孢杆菌DH82可以产出抗菌粗蛋白[24]，贝莱斯芽孢杆菌P9可以产出纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶[25](化学剂)。

甲基营养型芽孢杆菌MY1能够很好预防和治疗番茄灰霉病且与对照试剂腐霉利防效间没有显著差异[26]，甲基营养型芽孢杆菌265ZY3可作为复配菌肥菌种良好预防马铃薯干腐病[27](微生物剂)；甲基营养型芽孢杆菌BM47可以产出羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose)[28]，甲基营养型芽孢杆菌DCS1可以产出碱性淀粉酶(alkaline amylase)、生物表面活性剂(biosurfactant)[29](化学剂)。

2 4株芽孢杆菌形态及其应用特性数据

2.1 4株芽孢杆菌的菌株形态该实验室的芽孢杆菌菌株有4种：枯草芽孢杆菌1号、甲基营养型芽孢杆菌lw-6、贝莱斯芽孢杆菌RJW-5-5和解淀粉芽孢杆菌YF-6，菌株形态如图1所示。

图1 4株芽孢杆菌的菌株照片

枯草芽孢杆菌1号斜面底部褶皱较多，褶皱呈包围状；表面均匀，沙滩黄色；挑起时比较容易，湿度小。甲基营养型芽孢杆菌lw-6斜面底部褶皱非常多，褶皱呈放射状；表面布有垂直于生长方向的褶皱，暖灰色；挑起时局部完整性较高。贝莱斯芽孢杆菌RJW-5-5斜面底部褶皱较少，菌落易在菌株生长轮廓处积累；表面不够均匀，土黄色；挑起时易与培养基粘连。解淀粉芽孢杆菌YF-6斜面底部褶皱较少，菌株边沿光滑无积累；表面均匀且易反光，奶白色；挑起时黏稠但局部完整性较差。

2.2 4株芽孢杆菌的应用特征数据枯草芽孢杆菌1号能够减少作物土传病害、提高作物成活率、改善土壤团粒结构、抑制有害菌。枯草芽孢杆菌是该实验室的研究方法模板菌株。

甲基营养型芽孢杆菌lw-6对番茄灰霉病菌、稻瘟病菌有较强生防效果，LB液体培养基无菌发酵液对番茄灰霉病菌的菌丝生长抑制率为95.34%，EC50为10.18 mL/L；对稻瘟病菌的菌丝生长抑制率为92.56%，EC50为10.84 mL/L；LB液体培养基无菌发酵液对番茄灰霉病菌的孢子萌发抑制率为93.98%，EC50为2.03 mL/L；对稻瘟病菌的孢子萌发抑制率为92.09%，EC50为2.67 mL/L[30]。

贝莱斯芽孢杆菌RJW-5-5对一些作物真菌病菌有较好的抑菌带宽，对棉花枯萎病菌抑菌带宽为(15.1±0.1)mm、对西瓜炭疽病菌抑菌带宽为(11.97±0.15)mm、对马铃薯早疫病菌抑菌带宽为(11.43±0.59)mm、对玉米大斑病菌抑菌带宽为(11.40±0.53)mm。贝莱斯芽孢杆菌RJW-5-5对烟草K326赤星病相对防效可达(77.78±5.75)%。

解淀粉芽孢杆菌YF-6对一些作物病菌也有较好的抑菌带宽，对辣椒疫霉病菌抑菌带宽为(7.04±0.26)mm、对苹果炭疽病菌抑菌带宽为(10.54±0.26)mm、对棉花枯萎病菌抑菌带宽为(9.64±0.35)mm、对玉米大斑病菌抑菌带宽为(10.45±0.42)mm。9×106cfu/mL的解淀粉芽孢杆菌YF-6的LB液体培养基发酵液可以有效防止延安1号烟草赤星病的发生，且对延安1号烟草有促进生长的作用。

2.3 4株芽孢杆菌的生长曲线枯草芽孢杆菌1号的发酵生长曲线可以分为迟缓期、增多适应期、快速增多期、稳定增多期、稳定期5个阶段。由图2可知，生长曲线在2～14 h，菌量无明显增多，为迟缓期；在14～22 h，菌量增多先快后慢，为增多适应期；在22～32 h，菌量增多快速，为快速增多期；在32～60 h，菌量稳定增多，为稳定增多期；在60～96 h，菌量无明显变化，为稳定期。生长曲线在快速增多期斜率最大，斜率近似等于0.095 8；在稳定期的72 h达到最大值，最大值为2.156。选择快速增多期推算世代时间T，经计算，T枯草芽孢杆菌1号=2.17 h。

图2 4株芽孢杆菌的发酵生长曲线

甲基营养型芽孢杆菌lw-6的发酵生长曲线也可以分为迟缓期、增多适应期、快速增多期、稳定增多期、稳定期5个阶段。由图2可知，生长曲线在2～12 h，菌量无明显增多，为迟缓期；在12～22 h，菌量增多先快后慢，为增多适应期；在22～32 h，菌量增多快速，为快速增多期；32～52 h，菌量稳定增多，为稳定增多期；在52～96 h，菌量无明显变化，为稳定期。生长曲线在快速增多期斜率最大，斜率近似等于0.087 5；在稳定期的56 h到达最大值，最大值为2.279。选择快速增多期推算世代时间T，经计算，T甲基营养型芽孢杆菌lw-6=2.24 h。

贝莱斯芽孢杆菌RJW-5-5的发酵生长曲线同样可以分为迟缓期、增多适应期、快速增多期、稳定增多期、稳定期5个阶段。由图2可知，生长曲线在2～12 h，菌量无明显增多，为迟缓期；在12～22 h，菌量增多先快后慢，为增多适应期；在22～28 h，菌量增多快速，为快速增多期；28～56 h，菌量稳定增多，为稳定增多期；在56～96 h，菌量无明显变化，为稳定期。生长曲线在快速增多期斜率最大，斜率近似等于0.105 2；在稳定期的56 h到达最大值，最大值为2.049。选择快速增多期推算世代时间T，经计算，T贝莱斯芽孢杆菌RJW-5-5=3.96 h。

与前3株芽孢杆菌相同，解淀粉芽孢杆菌YF-6的发酵生长曲线可以分为迟缓期、增多适应期、快速增多期、稳定增多期、稳定期5个阶段。生长曲线在2～12 h，菌量无明显增多，为迟缓期；在12～22 h，菌量增多先快后慢，为增多适应期；在22～32 h，菌量增多快速，为快速增多期；在32～52 h，菌量稳定增多，为稳定增多期；在52～96 h，菌量无明显变化，为稳定期。生长曲线在快速增多期斜率最大，斜率近似等于0.090 2；在稳定期的84 h到达最大值，最大值为2.355。选择快速增多期推算世代时间T，经计算，T解淀粉芽孢杆菌YF-6=2.68 h。

4株芽孢杆菌不同生长时期末期参数如表1所示。

表1 4株芽孢杆菌不同生长时期末期OD600吸光度值

3 结语

抑菌谱显示甲基营养型芽孢杆菌lw-6、解淀粉芽孢杆菌YF-6、贝莱斯芽孢杆菌RJW-5-5对作物真菌性病害病原菌均有良好的拮抗作用。在烟草病害防治方面，枯草芽孢杆菌1号、甲基营养型芽孢杆菌lw-6已投入烟草黑胫病、烟草根黑腐病等烟草根茎类病害的防治工作，解淀粉芽孢杆菌YF-6、贝莱斯芽孢杆菌RJW-5-5已投入烟草赤星病病害的防治工作。

根据发酵生长曲线和对发酵现象的观察，推测以获得微生物剂为目标的发酵适宜在纯净且活跃的快速增多期取样，以获得化学剂为目标的发酵可以在复杂且强烈的稳定期取样；对以获得微生物助剂为目标的发酵，建议在明确益生元的前提下，改良营养基。枯草芽孢杆菌1号、甲基营养型芽孢杆菌lw-6、贝莱斯芽孢杆菌RJW-5-5、解淀粉芽孢杆菌YF-6均有发酵迟缓期、增多适应期、快速增多期、稳定增多期和稳定期。快速增多期细菌的代谢活性、酶活性高而稳定，大小比较一致，生活力强，因而广泛地在生产上被用作“种子”和在科研上作为理想的试验材料。找出4株芽孢杆菌的快速增多期对生产过程中的接种环节有参考意义，它可以缩短下一个发酵周期的延迟期从而缩短发酵周期，提高经济效益。