CTLA4-Ig 腹腔注射对大鼠实验性自身免疫性重症肌无力的治疗作用及其机制

2022-11-23焦子洋梁培鑫薛占霞郑立卿董晓华吴苗苗武海霞侯勇

山东医药 2022年30期

焦子洋，梁培鑫，薛占霞，郑立卿，董晓华，吴苗苗，武海霞，侯勇

河北北方学院药学院，河北省神经药理学重点实验室，河北张家口 075000

重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是一种慢性获得性自身免疫性疾病，其病因及发病机制尚未阐明，地塞米松是目前临床常用的MG 治疗药物［1］。研究［2-3］发现，胸腺淋巴细胞的凋亡失控可能是MG的主要发病机制之一。细胞凋亡（apoptosis）又称细胞程序化死亡（programmed cell death，PCD），是指机体为维持内环境稳定，由多基因严格控制的细胞主动死亡过程［4］。Fas、B 细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶（cysteinyl aspartate specific protease，Caspases）基因是调控淋巴细胞凋亡的相关基因［5-6］。凋亡相关因子Fas 能促进胸腺细胞的阴性选择，影响自身反应性胸腺细胞的凋亡［7］。Bcl-2 可抑制细胞凋亡，而B细胞淋巴瘤-2相关X 蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）可促进细胞凋亡，二者均参与胸腺细胞成熟过程中的正负选择［8］。Bcl-2 基因表达的上调可导致胸腺组织T 细胞具备抗凋亡能力，最终诱发MG［9］。Bax/Bcl-2 变化与MG 的预后密切相关［10］。此外，研究［11］表明，Caspase 家族也参与MG或实验性自身免疫性重症肌无力（experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG）胸腺细胞凋亡障碍的发生。细胞毒性T 淋巴细胞抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA4）是一种负性调控分子，可通过CD28/B7 介导的共刺激通路，防止细胞无序或过度活化，将免疫应答控制在可控范围［12］。细胞毒性T 淋巴细胞抗原4 免疫球蛋白（cytotoxic T lymphocyte antigen-4 immunolobulin，CTLA4-Ig）是由CTLA4 胞外区与IgG 的Fc 段融合构建而成的，可有效抑制初始T 细胞的活化，诱导T 细胞进入无能状态，表现为对特定抗原的不应答［13］。本研究组前期研究［14］结果表明，CTLA4-Ig 可通过抑制CD28/B7 信号通路，减缓MG 的发生发展；CTLA4-Ig 可抑制EAMG大鼠淋巴细胞的增殖。CTLA4-Ig是否通过影响胸腺组织相关凋亡基因的表达，发挥MG 治疗作用，目前尚未有相关报道。因此，我们观察了CTLA4-Ig 腹腔注射对大鼠EAMG 的治疗作用，并探讨其可能作用机制，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 45 只雌性Lewis 大鼠（7～8 周龄，体质量140～160 g）购自南京大学模型动物研究中心，在无特定病原体（no specific pathogen，SPF）环境中饲养，室温（24±2）℃，12 h 光/暗循环，40%～70%相对湿度，自由获得食物和水。本研究期间动物实验均严格遵守动物伦理要求。乙酰胆碱受体（AchR）α97-116肽序列、完全弗氏佐剂（CFA）、不完全弗氏佐剂（IFA）、AChRab 及AChR ELISA 试剂盒购于美国Sigma 公司；磷酸盐缓冲液（PBS）购于湖北武汉华东生物科技有限公司；地塞米松购于中国天津医药集团有限公司；CTLA4-Ig 购于美国BD公司；TRIzol 购于美国Invitrogen 公司；TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver. 3.0 购于中国大连宝生物工程有限公司。Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 活性检测试剂盒购于南京凯基生物发展有限公司产品。PCR扩增仪（德国），低温超速离心机（北京安亭仪器设备厂，中国）。

1.2 EAMG 模型构建取35 只大鼠，用AchR α 97-116 肽免疫法构建EAMG 大鼠模型。50 μg 的AChR α97-116 肽和CFA 混合制备200 μL 乳液，然后将其皮下注射至大鼠的颈部、背部和足垫区域（注射当天为第1 天）。第30、60 天分别在初次免疫注射部位等剂量进行强化免疫。另外10 只大鼠为正常对照（对照组），于同期予等量生理盐水。在第74 天评估EAMG 模型是否成功。依据大鼠临床表现判断EAMG 造模是否成功。与对照组比较，EAMG 模型大鼠造模2 周后出现爬行无力、背颈部皮毛松弛等MG 症状，4 周后症状明显加重，包括呼吸困难，头部震颤，背部出现肿块，毛发倒竖，行走困难，奄奄一息。最终30 只大鼠造模成功。

1.3 大鼠分组及CTLA4-Ig 给予方法将30 只EAMG 模型大鼠随机分为CTLA4-Ig 组、EAMG 组及地塞米松组，每组各10 只。第74 天时CTLA4-Ig 组大鼠用2 mg/kg 的CTLA4-Ig 腹腔注射，地塞米松组用1 mg/kg的地塞米松腹腔注射，EAMG组及对照组大鼠腹腔注射同体积PBS，1 天1 次（间隔24 h），持续至第130 天。CTLA4-Ig 给予期间，EAMG 组大鼠死亡1只，对照组麻醉死亡1只。因此每组选取9只大鼠进行后续实验。

1.4 各组大鼠体质量及肌力观察分别于第74、102、130 天记录各组大鼠体质量，观察并记录大鼠肌力。Lennon 评分0 级：没有显著的MG 症状，计0分；1 级：活动减少、轻微抓挠或哭声减少，计1 分；2级：前肢屈曲、低头、驼背、动作不协调，计2分；3级：严重的MG 表现，无哭无爬，震颤，处于垂死状态，计3分。如果大鼠的症状在上述4级之间，评分为0.5、1.5和2.5分。

1.5 标本留取及指标检测分别于第74、102、130天采集各组大鼠尾静脉血，第130 天同时采集大鼠后肢肌肉组织和胸腺组织。

1.5.1 各组大鼠血清AChR IgG、AChR IgG 2b 及后肢肌肉组织AChR 含量检测 ①采用ELISA 法检测血清AChR IgG、AChR IgG 2b。所有操作均严格按照试剂盒说明书进行，采用酶标仪测定450 nm 处的光密度（OD）值，重复测定3 次取平均值。②取各组大鼠后肢肌肉组织，0.01 mol/L PBS 匀浆后离心20 min。弃上清，将沉淀物重新悬浮含有2% Triton X-100 的缓冲液中。根据说明书，使用大鼠AChR ELISA 试剂盒检测上清液AChR 含量，重复测定3 次取平均值。

1.5.2 各组大鼠胸腺组织凋亡相关基因mRNA 检测采用RT-PCR 法检测各组大鼠胸腺组织Fas、FasL、Bcl-2、Bax、Caspases-3、Caspases-8和Caspases-9基因mRNA 表达。取各组大鼠胸腺组织，提取总RNA，紫外分光光度测定RNA浓度，参考文献［15］测定凋亡相关基因mRNA，以TATA 盒式蛋白编码基因（Tbp）为内参。根据试剂盒说明书加入各反应试剂进行逆转录及cDNA 扩增。逆转录反应程序：30 ℃、10 min，50 ℃、30 min，99 ℃、5 min，5 ℃、5 min；PCR扩增：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性40 s；51 ℃～57.5 ℃，复性40 s；72 ℃延伸40 s，循环35～40次，72 ℃延伸加时10 min。琼脂糖凝胶电泳，Fluorochem 5500成像系统采集图像，以各凋亡相关基因mRNA吸光度和Tbp吸光度比值表示其mRNA相对表达量。凋亡相关基因和Tbp的引物序列见表1。

表1 凋亡相关基因和Tbp引物序列

1.5.3 各组大鼠胸腺组织Caspases-3、Caspases-8和Caspases-9 活性检测采用紫外分光法检测各组大鼠胸腺组织Caspases-3、Caspases-8 和Caspases-9活性。所有操作均严格按照检测试剂盒说明书进行。测定405 nm时的最大吸收峰值即为Caspases-3、Caspases-8 和Caspases-9 活性值，重复测定3 次，取平均值。

1.6 统计学方法采用SPSS21.0 统计软件进行数据处理。采用Shapiro-Wilk 检验进行正态性检验，正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，如组间比较差异有统计学意义则采用LSD-t检验进行两两比较；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。