肝细胞癌组织中真核翻译起始因子6表达观察

熊伟，周铁军，佘琴，牟春如，杨成万

西南医科大学附属医院病理科，四川 泸州 646000

肝细胞癌（HCC）是临床上常见的恶性肿瘤之一。因早期症状隐匿，多数患者确诊时病情已进展至中晚期，五年生存率极低。因此，研究HCC 的发生发展机制、寻找新治疗靶点，对于制定合理HCC治疗策略，改善患者预后具有重要临床意义［1］。真核翻译起始因子6（eukaryotic initiation factor 6，EIF6），也被命名为ITGB4BP，是真核翻译起始因子家族的重要成员之一，参与调控蛋白质的翻译起始过程［2，3］。EIF6 作为一种抗缔合因子，能通过拮抗40S小核糖体亚基与60S亚基结合，影响延伸复合物80S亚基形成，发挥翻译起始阶段的限速作用［4］。鼻咽癌、胆囊癌、结肠癌等多种实体肿瘤的研究［5-7］表明，EIF6 表达异常与肿瘤的增殖、凋亡及不良预后有关。目前，EIF6在HCC 中的表达及其作用机制相关研究报道较少。我们观察了HCC 组织中EIF6 的表达变化，并分析其与HCC 患者临床病理参数及预后的关系，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择西南医科大学附属医院2014年12 月-2021 年8 月间收治的原发性HCC 患者116例，其中男103 例、女13 例；年龄29～84（53.99 ±10.38）岁；根据国际抗癌联盟/美国癌症分期联合委员会（UICC/AJCC）分期分为Ⅰ～Ⅱ期102 例、Ⅲ～Ⅳ期14 例；肿瘤直径＜5 cm 者60 例，≥5 cm 者56 例；HCC 分化程度分级参照2019消化系统肿瘤WHO 分类标准分为高分化23例、中分化73例、低分化20例；存在血管侵犯45 例，无侵犯71 例；存在卫星结节者26例，无90例；乙肝表面抗原（HBsAg）阳性77例，阴性39例；均无术前放疗、化疗、介入治疗等相关治疗史。116例患者均行肝癌根治术，术后病理检查明确诊断为原发性HCC，术中保存HCC 及癌旁组织石蜡标本备用，标本均经4%中性甲醛固定24 h 后取材，经常规脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片、染色。标本获取均按照伦理程序，并经医院伦理委员会审核通过。

1.2 HCC及癌旁组织EIF6检测 取HCC及癌旁组织标本，采用免疫组化Envision 两步法检测EIF6，所有操作均严格按照试剂说明书进行。兔抗人EIF6多克隆抗体（1∶150）购自上海赛信通生物试剂有限公司；DAB 显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；PBS磷酸盐缓冲液（粉剂）购自北京索莱宝科技有限公司；EDTA 抗原修复液（PH，9.0）购自北京澳博森生物技术有限公司。采用双盲法进行结果判读，由两名资深病理医师独立阅片并对切片进行判读，评分一致性达95%，取平均值为最终评分。EIF6蛋白阳性表达定位于细胞质，呈淡黄色至棕褐色，颗粒状或簇状分布。染色强度评分为无着色计0分、浅棕黄色计1分、棕黄色计2分、黄褐色计3分；随机选择10个高倍镜视野计算100个细胞中阳性细胞百分比平均值，阳性细胞百分比评分为无着色计0 分、＜10%计1 分、10%～30%计2 分、＞30%计3 分。细胞染色强度评分及阳性细胞百分比评分相乘为最终结果，0～2者为EIF6低表达，≥3者为EIF6高表达。

1.3 随访方法 临床病理资料及生存随访数据从病历档案和电话随访中获得。随访截至2022年1月24 日。将死于肝癌记为终点事件，生存时间均按月计算。116例患者中71例随访资料完整，45例失访。

1.4 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件进行数据处理。计数资料比较采用Fisher 确切概率法；EIF6 蛋白表达与HCC 患者临床病理参数的关系均采用χ2 检验；EIF6 表达对HCC 患者生存期的影响采用Kaplan-Meier 法、用Log-rank 法进行差异性检验；分别采用单因素和多因素Cox 回归分析法分析HCC 患者预后的独立影响因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC 及癌旁组织EIF6蛋白表达情况 HCC 组织中EIF6 蛋白高表达76 例、低表达40 例，癌旁组织中EIF6 蛋白高表达12 例、低表达104 例。与癌旁组织比较，HCC组织EIF6表达升高（P＜0.05）。

2.2 不同临床病理参数的HCC患者癌组织EIF6表达情况 不同临床病理参数的HCC 患者癌组织EIF6表达情况见表1。

表1 不同临床病理参数的HCC患者癌组织EIF6表达情况（例）

EIF6 表达与HCC 患者HBsAg、分化程度、TNM分期有关（P均＜0.05），而与患者性别、年龄、肿瘤直径、有无卫星结节、有无血管侵犯无关（P均＞0.05）。

2.3 HCC 组织中EIF6表达对患者预后的影响 71例HCC患者分为EIF6低表达者26例和EIF6高表达者45 例，中位生存时间为53 个月。Kaplan-Meier 生存曲线分析结果显示，与EIF6 低表达者比较，EIF6高表达的HCC 患者生存时间短（P＜0.05）。不同EIF6表达的HCC患者的生存曲线见图1。

图1 不同EIF6表达的HCC患者的生存曲线

单因素Cox回归分析结果表明，EIF6表达、TNM分期与HCC 患者预后有关（HR分别为8.590、0.313，P=0.037、0.032＜0.05），而与患者性别、年龄、肿瘤直径、HBsAg、有无卫星结节、有无血管侵犯、分化程度等均无关（P 均＞0.05）。多因素Cox 回归分析结果表明，EIF6 表达、TNM 分期均不是HCC患者预后的独立影响因素（HR 分别为7.129、0.485；P均＞0.05）。

3 讨论

原发性肝癌是临床常见的恶性肿瘤之一，常见的组织学类型包括HCC 及胆管细胞癌，其中以HCC最为常见。HCC 的发生常常与肝炎病毒感染、黄曲霉毒素中毒、非酒精性脂肪肝病有关，我国以病毒性肝炎引起的HCC 尤为多见。目前临床常用的治疗手段包括手术治疗、经肝动脉化疗栓塞术、放化疗及分子靶向治疗等方法。但因其恶性程度高、早期起病隐匿，确诊患者大多为中晚期患者等特点，常导致临床治疗效果欠佳［8-9］。因此，研究HCC的发生发展机制显得尤为重要。同其他实体肿瘤一样，HCC 的发生是其基因出现异常所致。真核生物要完成基因表达需要两个关键步骤，即转录和翻译，而真核生物成熟信使RNA（mRNA）的翻译是一个涉及了多种分子机制的复杂过程，该过程大致由起始、延长、终止三个阶段构成［10-11］。该过程可被调控，而调控多发生在翻译过程的起始阶段，整个调控过程需要至少12 个蛋白质因子参与，即真核翻译起始因子（ElFs）［12-13］。

真核生物进行翻译起始过程的主要分子机制就是依赖于m7G 帽结构的核糖体扫描机制（m7G capdependent scanning mechanism）。首先，40S 亚基与三元复合物（EIF2-GTP-Met-tRNAiMet）可通过翻译起始因EIF1、EIF1A、EIF3 和EIF5 等的作用，结合形成43S 前起始复合物（preinitiation complex，PIC）；而EIF4E 能与mRNA 5'末端的m7G 帽结构进行绑定，进一步激活mRNA。随后，43S 复合物就与激活的mRNA 区域相互结合，43S 复合物沿着mRNA 从5'至3'的方向扫描5'UTR，直至起始密码子AUG 处，此时60S 亚基加入，延伸复合物80S 形成，延伸过程开始。其中EIF6 能够通过与60S 亚基结合的方式，来拮抗60S 亚基与40S 亚基在翻译起始阶段的过早结合，从而阻止没有mRNA 的80S 亚基的形成，以此来发挥其限速调节作用［10，14-16］。

EIF6 在胆囊癌［6］、鼻咽癌［5］、甲状腺癌［17］、胶质母细胞瘤［18］等多种恶性肿瘤中均有高表达，且发现其与Shwachman-Diamond 综合征等遗传性疾病有一定关系［19］。多项研究均表明，EIF6 参与了多种恶性肿瘤的发生和发展过程。在三阴性乳腺癌中，EIF6通过激活Myh9/Wnt/β-catenin 信号通路，显著增强三阴性乳腺癌细胞的增殖和侵袭［20］。同样在口腔鳞状细胞癌组织中也发现EIF6 存在高表达，在体外过表达EIF6 基因后发现肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移及上皮-间充质转化等能力被显著提升，通过免疫共沉淀实验发现EIF6 蛋白和AKT 蛋白在胞质中直接相互作用，提示该过程与AKT 相关信号通路密切相关［21］。以上多项研究提示EIF6 作为影响翻译起始的重要分子，可通过影响多条信号通路来参与实体肿瘤的发生发展，未来有望作为肿瘤治疗的靶点之一。

本研究通过免疫组化法进行分析，发现HCC 组织中EIF6 蛋白表达明显高于对应癌旁组织，且与HCC的分化程度以及TNM分期明显相关，提示EIF6可能在HCC 发生发展中发挥作用。进一步研究还发现，EIF6 的表达与HCC 患者HBsAg 感染有关，提示乙肝病毒的感染可能也对EIF6 的高表达有促进作用。通过Kaplan-Meier 生存分析发现，EIF6 与HCC 的总生存时间呈负相关，高表达患者的术后生存时间明显低于低表达患者，提示EIF6 高表达的HCC 患者预后更差。Cox 单因素分析结果表明，EIF6 表达水平、TNM 分期都是影响患者生存时间的相关因素，差异有统计学意义。但Cox 多因素分析表明EIF6 表达水平尚不能作为影响肝细胞癌患者预后的独立因素，这可能与选取样本量不足有关。在后续研究中可增加样本数量，进一步分析影响HCC预后的独立危险因素。

本研究为单中心、回顾性研究，且纳入样本量相对较小，且并未深入探讨EIF6基因在HCC患者不良预后中的分子机制。因此，EIF6 基因是否能作为一个有效的肿瘤标志物，今后还有待多中心、前瞻性且大样本的研究进一步探索。

综上所述，HCC组织中EIF6高表达。EIF6高表达提示肿瘤恶性程度高、预后不佳，可作为影响HCC 患者预后的重要因素，但EIF6 表达、TNM 分期不是HCC 患者预后的独立影响因素。EIF6 可能参与HCC 的发生、发展，可作为HCC 不良预后的参考指标及潜在治疗靶点。