微残清颗粒含药血清对CD34+CD38-KG1a 细胞增殖凋亡的影响及其作用机制

闫理想，姜静，杨向东，何敬，杨曦，陈海静，李德冠，史哲新

1 天津中医药大学第一附属医院血液科国家中医针灸临床医学研究中心，300381 天津；2 天津市中医药研究院附属医院消化二科；3 中国医学科学院放射医学研究所

白血病干细胞（Leukemia stem cells，LSC）可能在白血病的发生、发展中发挥重要作用，与白血病的复发及多药耐药有关［1-2］。消除LSC 或逆转LSC细胞耐药有助于提高白血病疗效。LSC 细胞多药耐药不仅与Wnt、PI3K/AKt 等信号通路的表达异常有关，还与多药耐药负调控因子的活性降低或缺失有关，如Ⅰ型跨膜糖蛋白（CD95）［3］、拓扑异构酶Ⅱα（TOPOⅡα）［4］及人第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（PTEN）［5］缺失或表达下调等。中医理论认为，白血病是正气虚损、内邪滋生、邪毒内侵导致的，其治疗以扶正解毒为原则。基于白血病复发耐药发病机制及治疗原则，我科在当归补血汤、四君子汤及青黄散等经典方剂基础上，结合多年临床实践总结出微残清颗粒方剂。我们前期研究［6］发现，微残清颗粒辅助治疗可提高难治性急性白血病患者的临床疗效，一定程度逆转LSC细胞的耐药，但其具体作用机制尚不明确。我们观察了微残清颗粒含药血清与柔红霉素共培养对耐药白血病细胞（CD34+CD38-KG1a 细胞）增殖、细胞周期及凋亡情况的影响，并探讨其可能作用机制，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物、试剂及仪器 人急性骨髓白血病KG1a细胞株由中国医学科学院血液病研究所馈赠。20只SPF级新西兰大白兔（6月龄），雌雄各10只，体质量2.5～3.0 kg，购于北京华阜康公司（SCXK（京）2014-0004）。饲养于中国医学科学院放射医学研究所动物房，适应性饲养1 周。注射液盐酸柔红霉素（20 mg，15049039）购自美国辉瑞；微残清颗粒（黄芪30 g，当归15 g，全蝎9 g，青黛9 g，雄黄0.3 g，人参10 g，白术15 g，茯苓15g，甘草10 g）由我院中药制剂实验室采用单药颗粒制备技术制备而成，无菌干燥后密封于塑封袋中备用，应用时灭菌注射用水配置成1 g/mL 冲剂，105 ℃蒸汽灭菌。实时定量PCR 仪（CFX96，美国Bio-rad）、流式细胞仪（C6 型，美国BD）；荧光成像系统（ChemiDoc MP，Bio-rad）。CD34、CD38 磁珠（130-046-702，130-092-263，Miltenyi Biotec）；CCK-8 试剂盒（40203ES60，上海前尘生物）；CD95、PTEN、TOPO Ⅱα 抗 体（sc-8009、sc-165986、sc-133197，Santa Cruz）；羊抗兔IgG 抗体（CW0103S，北京康为世纪）；RNA、cDNA 提取试剂（CW0597、CW0741A，北京康为世纪；PCR 试剂盒（PR7012，北京百泰克生物）。

1.2 CD34+CD38-KG1a 细胞培养、分选、微残清颗粒含药血清培养方法

1.2.1 CD34+CD38-KG1a 细胞分选 KG1a 细胞常规培养于含柔红霉素（1ug/ml）的培养液中，以保持其耐药性。取对数生长期KG1a 细胞，采用免疫磁珠法分选CD34+CD38-KG1a 细胞，所有操作均严格按试剂使用说明书操作。采用流式细胞术检测分选前后CD34+CD38-KG1a 细胞亚群比例，分选前后CD34+CD38-KG1a细胞比例分别为45.6%±4.36%、97.2%±2.53%，分选后CD34+CD38-KG1a细胞比例达到95%以上，符合后续实验要求。

1.2.2 微残清颗粒含药血清制备 20 只大白兔随机分为中药组和空白组，每组各10 只。根据黄继汉［7］人鼠剂量换算方法，中药组给予微残清颗粒水煎剂8 mL（1 g/mL）灌胃，2 次/日，连续灌胃7 d；空白组予0.9%生理盐水8 mL 灌胃，时间频率同中药组。灌胃第7 天末次给药2 h 心脏取血5 mL。常规离心分离血清，同组兔混匀后过滤分装，备用。

1.2.3 细胞分组及微残清颗粒含药血清培养方法 取4×104/mL 的CD34+CD38-KG1a 细胞分为A、B、C、D 组，接种于96 孔板，每孔100 μL，每组5 个复孔。A 组用微残清颗粒含药血清（血清为终体积20%）+柔红霉素1.25 μg/mL［8］培养，B 组加入微残清颗粒含药血清（血清为终体积20%）培养，C 组加入1.25 μg/mL 的柔红霉素培养，D 组为空白对照组，加入正常细胞培养液培养。

1.3 各组细胞增殖情况观察 分别于培养24、48、72 h 时，向各组培养板每孔中加入8 μL CCK8 溶液，然后常温培养箱内孵育1 h后，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度值所有操作均严格按照说明书进行。测算各组细胞增殖抑制率，细胞增生抑制率（%）=（1-实验组OD 值/对照组OD 值）×100%。重复3 次取平均值。

1.4 各组细胞周期、细胞凋亡及CD95 表达观察 培养72 h时取各组细胞，离心5 min，PBS清洗2次，调节细胞浓度为5×105/mL，加入-20 ℃预冷70%乙醇2 mL 固定，RNase 消化，4 ℃放置24 h，PBS 洗2次，每管加入PI（50 μg/mL）1 mL，采用流式细胞仪检测各组细胞周期，AUXIN-V 法测算各组细胞凋亡率（早期细胞凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率）。另取培养72 h 各组细胞，2 000 r/min 离心5 min 去上清，避光分别加入CD95 抗体5 μL，同时设空白对照，37 ℃恒温箱避光孵育15 min，1 mL PBS 混匀、离心后弃上清，加入50 μL PBS 混匀，上机测算CD95阳性比例。实验均重复测算3次，取平均值。

1.5 各组细胞TOPOⅡα、PTEN mRNA 及蛋白检测 ①采用RT-PCR 法检测各组细胞TOPOⅡα、PTEN mRNA：培养72 h 时取各组细胞，采用TRIzol法提取总RNA，逆转录为cDNA，所有操作步骤严格按照试剂说明书进行。RT- PCR 反应细胞TOPOⅡα、PTEN mRNA，引物序列由上海生工公司合成。β-actin（上游引物：5，-CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3，，下游引物5，- AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3，）、PTEN（上游引物5，-ACCAGGACCAGAGGAAACCT-3，，下游引物 5，-GCTAGCCTCTGGATTTGACG-3，）、TOPO Ⅱα（上游引物：5，-GCCCTCCTGCTACACATTTC-3，，下游引物5，-AACACTTGGGCTTTACTTCACTT-3，）。以2-ΔΔCt代表目的基因的相对表达量，重复检测3 次取平均值。②采用WESTERN Blotting 检测各组细胞TOPOⅡα、PTEN 蛋白：培养72 h 时取各组细胞混匀，PBS（0.01 mol/L，pH 7.0～7.2）冲洗3 次，加1 mL 液氮研磨，200 μL 蛋白裂解液混匀，4 ℃摇晃震荡10 min，冰上裂解30 min，离心（12 000 r/min，4 ℃，30 min）后取上清总蛋白。采用BCA法检测蛋白，变性、离心（10 000 r/min，常温，30 s），取上清进行SDS-PAGE，所有操作均严格按照试剂说明书操作。应用Image Lab 4.0 软件，以D 组为基量（相对定量为1），测算各组细胞TOPOⅡα、PTEN 蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.6 统计学方法 采用SPSS 16.0 统计软件进行数据处理。采用P-P 图检验数据的正态性，符合正态分布的计量数据以±s表示，组间比较采用t检验或单因素方差检验；计数资料比较采用χ2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 培养24、48、72 h 时各组细胞增殖抑制率比较 培养24、48、72 h时各组细胞增殖抑制率比较见表1。

表1 培养24、48、72 h时各组细胞增殖抑制率比较（%，-x±s）

2.2 培养72 h 时各组细胞周期比例比较 培养72 h时各组细胞周期比例比较见表2。

表2 培养72 h时各组细胞周期比例比较（%，±s）

表2 培养72 h时各组细胞周期比例比较（%，±s）

注：与D组比较，*P＜0.05；与C组比较，△P＜0.05。

组别A组B组C组D组G2/M 17.90±1.10*△18.80±2.74*△10.25±2.11 10.75±1.02 G0/G1 66.35±2.34*△65.19±3.48*△77.51±2.20 74.87±1.64 S 15.74±1.46 16.00±2.06 12.23±0.60 14.77±1.91

2.3 培养72 h时各组细胞凋亡率比较 培养72 h时各组细胞凋亡率比较见表3。WCQ 组、WCQ+DNR组的早期凋亡明显升高，在晚期凋亡上仅有WCQ+DNR组的比例明显升高，差异具有统计学意义。

表3 培养72 h时各组细胞凋亡率比较（%，±s）

表3 培养72 h时各组细胞凋亡率比较（%，±s）

注：与B组比较，*P＜0.05；与C组比较，△P＜0.052.4 培养72 h时

组别A组B组C组D组细胞凋亡率晚期凋亡率28.95±1.66*10.85±0.82△14.13±1.86 14.56±1.69总凋亡率55.24±2.71*31.23±2.36 26.11±2.38 27.25±1.36早期凋亡率29.29±1.88*20.34±1.49△10.18±0.97 11.59±1.94

2.4 各组CD95 阳性细胞比例比较 培养72 h 时A、B、C、D 组CD95 阳性细胞比例 分别为16.50% ±2.62%、9.60% ± 1.73%、5.00% ± 3.06%、7.70% ±2.51%，与B、C、D 组比较，A 组CD95 阳性细胞比例高（P均＜0.05）。

2.5 培养72 h 时各组细胞PTEN、TOPOⅡα mRNA相对表达量比较 培养48 h 时A、B、C、组细胞PTEN mRNA 相 对 表 达 量 分 别 为27.34 ± 4.16、7.52 ± 2.48、1.87 ± 0.69，与D 组 比 较，A、B 组PTEN mRNA 相对表达量升高（P 均＜0.05），与C 组比较，A、B 组PTEN mRNA 相对表达量升高（P 均＜0.05）；TOPOⅡα mRNA 相对表达量分别为12.74±2.53、1.08±1.16、0.75±0.62，与C、D组比较，A组TOPOⅡα mRNA相对表达量升高（P均＜0.05）。

2.6 培养72 h 时各组细胞PTEN、TOPOⅡα 蛋白相对表达量比较 培养48 h 时A、B、C、组细胞PTEN蛋白相对表达量分别为2.3 ± 0.41、1.99 ± 0.27、0.92±0.26，与D 组比较，A、B 组PTEN 蛋白相对表达量升高，与C 组比较，A、B 组PTEN 蛋白相对表达量升高（P 均＜0.05）；TOPOⅡα 蛋白相对表达量分别为1.68±0.16、1.47±0.53、0.61±0.19，与D 组比较，A 组TOPO Ⅱα 蛋白相对表达量升高（P＜0.05），与C 组比较，A、B 组TOPOⅡα 蛋白相对表达量升高（P均＜0.05）。

3 讨论

LSC 多药耐药是白血病复发难治的根源，尽管其发生的机制是复杂多样的，但不外乎正调控与负调控两方面，其中负调控蛋白CD95、负调控酶TopoⅡα和负调控基因PTEN 是近年来研究的热点，这些负调控因子的活性降低或缺失与LSC多药耐药的发生有着密切的关系。负调控蛋白CD95（又称Fas，Apo-1）是细胞表面膜蛋白受体分子，分子量48ku，CD95 与其天然配体（FasL）结合后可向敏感靶细胞内传递死亡信号而诱导凋亡。近年研究已证实，多药耐药病人CD95低表达或活性降低，通过Fas/FasL凋亡途径参与LSC 多药耐药［9］。负调控酶TopoⅡα是蒽环类化疗药物作用靶点，蒽环类药物和TopoⅡα 结合，抑制DNA 再连接，阻止细胞复制，TopoⅡα 高表达有利于蒽环类药物敏感，相反多药耐药的LSC低表达TopoⅡα，提高TopoⅡα表达及活性就是增强拓扑异构酶抑制剂作用效果［10］。研究发现，TopoⅡα 的高表达可提高化疗病理反应性［11］。负调控基因PTEN 在急性白血病、非霍奇金淋巴瘤等中存在不同程度的低表达或杂合性缺失［12-13］，研究证实PI3K/Akt/mTOR 通路的活化与PTEN 的低表达或缺失相关，而该通路为细胞凋亡、耐药的重要通路［14］。

基于白血病复发“髓虚邪伏，邪毒致变”的机制，治则当以益气养阴以扶正，解毒以祛邪，本课题组根据这一中医病理变化提出益气养阴解毒法。经多年临床实践，证实该治法在复发难治白血病的治疗中具有较好的临床效果，该治法选用经典方剂当归补血汤、四君子汤合青黄散加减共奏益气养阴解毒之功，方药选用黄芪、当归益气养血为君，全蝎、青黛、雄黄解毒攻毒为臣，人参、白术、茯苓、甘草益气健脾为佐使，全方攻补兼施，顾护正气，驱邪不伤正，扶正不留邪。我们前期研究发现，常规化疗配合微残清颗粒药可提高难治性急性白血病患者的临床疗效，推测微残清颗粒可能具有增加患者对常规化疗药的敏感性，具有逆转难治性急性白血病耐药的作用，但其作用机制尚不清楚［6］。我们的研究发现，与空白组比较，微残清颗粒含药血清单独培养时对耐药CD34+CD38-KG1a 并未表现出明显的抑制作用，而单独柔红霉素组的抑制率亦低于微残清含药血清联合柔红霉素组，结果表明微残清颗粒单独用药抗白血病耐药效果不显著，而与柔红霉素联合应用后细胞增殖明显抑制，提示微残清颗粒可能具有逆转耐药的作用，从而增加白血病干细胞对化疗药物的敏感性。进一步研究发现，微残清颗粒组和微残清颗粒联合柔红霉素组均可促进CD34+CD38-KG1a 细胞进入细胞周期及凋亡，尤其表现在早期凋亡上，提示微残清颗粒逆转耐药的途径可能是促进KG1a 干细胞进入细胞周期，增加分化凋亡，进而增强DNR 对KG1a干细胞的抑制作用。同时我们发现，微残清颗粒可提高KG1a 干细胞膜蛋白CD95 的表达，在联合DNR 时可提高TOPOⅡα、PTEN 蛋白及mRNA 的表达，单独微残清颗粒仅可提高PTEN mRNA，对TOPOⅡα mRNA 未见明显干预作用，提示微残清颗粒具有逆转LSC耐药作用的机制可能是通过调控膜蛋 白CD95、TOPO Ⅱα、PTEN 耐 药 负 调 控 因 子 而实现。

综上所述，加入微残清颗粒含药血清与柔红霉素可抑制CD34+CD38-KG1a 细胞的增殖、降低G0/G1期细胞比例、增加G2/M期细胞比例，促进细胞凋亡，其可能机制为微残清颗粒含药血清可提高CD34+CD38-KG1a 细胞CD95 的阳性比例、促进细胞PTEN、TOPOⅡαmRNA 及蛋白表达。微残清颗粒含药血清可增加KG1a 干细胞对柔红霉素的药物敏感性，其机制可能是微残清颗粒通过活化CD95、PTEN及TOPOⅡα 负调控因子影响KG1a干细胞的细胞周期及凋亡。但LSC 细胞的多药耐药机制复杂，涉及蛋白磷酸化、基因甲基化等诸多调控因子的干预，而微残清颗粒的效成分及具体药理作用后续仍需进一步深入研究探讨。