纳米氧化物对耐四环素屎肠球菌的毒性研究及机制初探

高艺凡，毛步云，王艺，程远，袁青彬,*

1. 南京工业大学环境科学与工程学院，南京 211816 2. 南京水务集团有限公司，南京 210000

纳米材料的大量生产、使用和排放使其在环境中大量存在，已经成为不可忽视的一类环境污染物[1]。各种环境中已经检出了各类纳米材料残留[2-3]，其中城市污水厂是重要的储存库之一，据报道污水中纳米材料的检出浓度可达μg·L-1至mg·L-1[4-7]。如Tan等[8]报道污水中ZnO浓度的可达mg·L-1水平。环境中纳米材料具有显著的生态环境效应，如使机体产生氧化应激和炎症反应，从而造成机体损伤甚至死亡[9-11]。对于细菌，纳米材料如纳米氧化物等可以触发氧化应激反应使细菌破裂而引发凋亡[12-13]。纳米材料对细菌的毒性一般既有本身纳米级尺寸具有的毒性效应，也有纳米材料溶解成为离子引发的毒性[14-17]。由于城市污水同样是一类近年来普遍关注的新污染物耐药细菌的重要储存库[18-21]，纳米材料和耐药细菌有广泛共存，存在大量相互接触和作用的机会，因此纳米材料势必也会对耐药细菌造成影响，从而导致细菌耐药性风险的变化，但目前对于纳米材料对耐药细菌影响的相关研究仍非常有限。

笔者课题组在前期研究中以耐药性大肠杆菌为例初步考察了纳米氧化物对耐药革兰氏阴性细菌的影响，发现纳米氧化物造成了耐药细菌的部分死亡以及耐药水平等方面的变化[22]，为纳米材料影响耐药细菌的研究提供了参考。本研究从污水中分离出耐四环素性屎肠球菌，以此为例考察了3种污水中广泛存在的纳米氧化物纳米氧化钛（nTiO2）、纳米氧化锌（nZnO）和纳米氧化铜（nCuO）[18]对革兰氏阳性细菌的毒性。屎肠球菌是一种重要的人畜共患条件性致病菌，美国已将其列为引起临床感染的第二大病原菌[23-24]，屎肠球菌在城市污水、医院废水等环境中也被广泛检出[25]。本文研究了不同种类、粒径、浓度和在水中的赋存时间的3种纳米氧化物对耐四环素性屎肠球菌的存活率的影响。在此基础上初步考察了纳米氧化物对耐药性屎肠球菌的细胞膜影响，探索了影响机制。本研究将为阐明纳米材料对各类耐药细菌的影响及机制提供支撑。

1 材料与方法（Materials and methods）

1.1 纳米材料及细菌

本实验使用的纳米氧化物为由上海盈承新材料有限公司购得的nZnO （30、50、90和200 nm）、nCuO （40 nm）和nTiO2（5～10、25、40和100 nm），3种纯度达99.9%的商品纳米氧化物材料。为避免可能存在的添加剂对实验的影响，纳米氧化物在使用前于水中超声分散10 min后于去离子水中浸泡12 h过夜，离心回收后备用。使用前，将纳米氧化物加入到经0.45 μm和0.22 μm 2种尺寸滤膜过滤的二沉池出水，配制成浓度不同的纳米颗粒悬浮液，并将其超声混匀后静置备用。另外，分别测定纳米氧化物的水合粒径和溶解的金属离子浓度。将不同浓度和粒径的纳米氧化物配制成为悬浮液，使用纳米粒度电位仪（Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, UK）对nZnO的水合粒径进行检测。将样品离心，弃去上清液后用稀硝酸消解后，使用ICP-OES（Avio 550, Perkinelmer, USA）测定溶解的离子浓度。

耐四环素屎肠球菌分离自于南京市某城镇污水厂活性污泥，将采集的新鲜活性污泥梯度稀释后涂板至含有四环素（36 mg·L-1）的粪肠球菌琼脂选择性培养基（HB0268-2，海博生物，中国），根据菌落特征初步筛选若干粪肠球菌菌落，纯化培养后送至南京金思瑞生物科技公司测序鉴定细菌种类为屎肠球菌Enterococcusfaecium7039809-1（MH385356.1）。而后通过使用PCR检测确认此菌种带有四环素类抗性基因tetM和tetL。

1.2 纳米氧化物对耐四环素屎肠球菌毒性的毒性测定

在避光条件下，将活化后的耐四环素屎肠球菌离心后重悬至经0.45 μm和0.22 μm 2种尺寸滤膜过滤的二沉池出水（经平板计数确认细菌被完全去除），加入一定量的纳米氧化物悬浮液后在恒温振荡培养箱中振荡反应30 min。取1 mL反应后的细菌悬浊液梯度加入含有四环素（36 mg·L-1）的LB培养基中培养，每个培养皿加入细菌量为10 mL左右，待冷却凝固后放入恒温培养箱中37 ℃培养96 h，记录各培养基中菌落数（N1），同时将没有加入纳米氧化物的细菌溶液同样参照上述步骤培养，记录培养基中菌落数（N0），计算耐四环素屎肠球菌的存活率（式（1））。

存活率=N1/N0×100%

（1）

为考察纳米氧化物种类以及粒径对毒性的影响，分别考察nZnO、nCuO和nTiO23种纳米氧化物在10 mg·L-1和100 mg·L-1和不同粒径下的耐四环素屎肠球菌的存活率；为考察纳米氧化物浓度对毒性的影响，以nZnO和nTiO2为例考察0、10、20、50和100 mg·L-1的2种纳米氧化物反应后耐四环素屎肠球菌的存活率；为考察纳米氧化物赋存形态对毒性的影响，将纳米氧化物悬浮液静置0、3和6 h后进行毒性测定，考察耐四环素屎肠球菌存活率。

1.3 纳米氧化物对耐四环素屎肠球菌细胞膜的影响

使用乳酸脱氢酶释放法考察纳米氧化物对耐四环素屎肠球菌细胞膜的影响。其原理是细胞凋亡或坏死而造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）。通过检测从质膜破裂的细胞中释放到培养液中的LDH的活性，就可以实现对细胞毒性的定量分析[26]。采用试剂盒（Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST，东仁化学科技（上海）有限公司，中国）进行测定，将接触纳米氧化物的耐四环素屎肠球菌离心后置于96孔板中作为实验组，按照说明书提示的溶液量加入对应的样品制成对照组和背景组，依次加入反应试剂充分反应后立即用酶标仪测定各孔在490 nm的吸光度。而后通过计算得出本实验中的LDH活性计算式（式（2）），并采用计算出的LDH活性单位为标准，表示细胞的氧化应激作用。

LDH活性单位计算式：

LDH（U·mL-1）=ΔA÷0.725÷T×103=92×ΔA

（2）

式中：ΔA为测定吸光度与对照吸光度之差，T为每微摩尔标准品稀释所用溶液的体积（L）。

1.4 数据分析

采用P=0.05水平考察不同处理之间的显著性差异，当P<0.05时认为数据之间存在显著不同。采用Pearson相关性分析考察2组数据间的相关性。上述数据处理过程均在Origin 9.0软件中进行。

2 结果（Results）

2.1 纳米氧化物种类对耐四环素屎肠球菌毒性的影响

首先考察了3种常见的纳米氧化物对耐四环素屎肠球菌存活率的影响（图1）。可以发现，在暴露浓度为10 mg·L-1和100 mg·L-1时3种纳米氧化物的毒性顺序一致，即nCuO>nZnO>nTiO2（P<0.05）。在3种纳米氧化物中nCuO的毒性最强，10 mg·L-1即造成37.03%的细菌死亡。相比之下，nTiO2毒性相对较低，在100 mg·L-1时的致死率仅为nZnO的63.72%。

2.2 浓度和粒径对纳米氧化物对于耐四环素屎肠球菌毒性的影响

以nTiO2和nZnO为例考察了浓度和粒径对纳米氧化物对于耐四环素屎肠球菌毒性的影响（图2）。

图1 不同种类纳米氧化物对耐四环素屎肠球菌存活率的影响注：（a） 纳米氧化物的浓度为10 mg·L-1；（b） 纳米氧化物的浓度为100 mg·L-1。Fig. 1 The effect of different kinds of nano metal oxides on the survival rate of tetracycline resistant Enterococcus faeciumNote: （a） Nano-oxides at the concentration of 10 mg·L-1; （b） Nano-oxides at the concentration of 100 mg·L-1.

图2 不同纳米氧化物浓度和粒径对耐四环素屎肠球菌存活率的影响注：（a）不同浓度的nTiO2；（b）不同浓度的nZnO；（c）不同粒径的nTiO2；（d）不同粒径的nZnO。Fig. 2 The influence of different nano metal oxide concentration and size on the survival rate of tetracycline resistant Enterococcus faeciumNote: （a） Different concentrations of nTiO2; （b） Different concentrations of nZnO; （c） Different size of nTiO2; （d） Different size of nZnO.

由（图2（a））可知，10 mg·L-1相同粒径和形态的nTiO2胁迫下，细菌存活率约为73.38%；当浓度从10 mg·L-1提高时，存活率呈降低趋势，至50 mg·L-1时存活率仅为58.67%，表明毒性随浓度提高而增强，但当浓度由50 mg·L-1提升至100 mg·L-1时，存活率并未出现继续下降，反而有所升高，此时存活率为70.60%。nZnO的毒性随浓度变化的趋势与nTiO2类似，即存活率先降低到50 mg·L-1时的最低值（36.00%），继而升高至48.85%。

从粒径对纳米氧化物的毒性影响来看，粒径变大时，存活率呈降低趋势，表明毒性不断加大，如粒径90 nm的ZnO较粒径30 nm使耐四环素屎肠球菌的存活率降低了32%，粒径40 nm的nTiO2的较粒径5～10 nm的nTiO2作用下，耐药细菌的存活率降低了16%。然而纳米氧化物的毒性并不随粒径的增大持续增大，当nZnO的粒径由90 nm提高到200 nm时毒性发生明显降低，细菌存活率提高了19%；nTiO2在100 nm时的毒性比40 nm上升了9%。

2.3 赋存时间对纳米氧化物对于耐四环素屎肠球菌毒性的影响

实验设置的3个赋存时间0、3和6 h，可认为反映了纳米材料排放至水中的不同状态，如赋存0 h为纳米氧化物刚进入污水中，赋存3 h为含纳米氧化物的污水经排水管网进入污水厂的途中，赋存6 h为在污水处理厂处理的阶段。以nTiO2和nZnO为例，考察上述3种赋存时间对纳米氧化物毒性的影响（图3）。nZnO悬浮液赋存时间为0 h时细菌细胞存活率为48.85%，历经6 h后细菌存活率下降了22.15%。同样地，100 mg·L-1nTiO2悬浮液赋存时间为0 h时细菌细胞存活率为70.60%，历经6 h后细菌细胞存活率下降了8.34%，即随着赋存时间的延长，细菌的存活率呈降低趋势（P<0.05），表明纳米氧化物的毒性不断增大。

2.4 耐药细菌的通透性受纳米氧化物的影响规律

通过测定LDH活性值来反映细胞通透性，从而考察不同种类、粒径、浓度和赋存时间对纳米氧化物毒性的影响机制（图4）。从种类的影响来看，对细胞通透性影响的大小顺序为nZnO、nCuO和nTiO2，该顺序与前述纳米氧化物的毒性顺序存在差异，主要是nZnO取代nCuO成为使通透性提高最多的种类。从浓度的影响看，通透性随着浓度的提高不断提高，如nCuO浓度从10 mg·L-1依次增加到100 mg·L-1时，LDH的值提高了1.809 U·mL-1，当nAl2O3浓度从10 mg·L-1依次增加到100 mg·L-1时，LDH的值提高了0.708 U·mL-1。从粒径的影响看，通透性随着纳米氧化物粒径的提高而不断提高。如nTiO2粒径从5 nm依次增加到100 nm，LDH提高了0.269 U·mL-1。当nZnO粒径从30 nm增加到200 nm时，LDH提高了0.892 U·mL-1。从赋存时间的影响看，赋存时间的延长使通透性不断提高。如nCuO（10 mg·L-1）悬浮液赋存时间从0 h到6 h，LDH提高了0.613 U·mL-1，而在100 mg·L-1的条件下提高了0.474 U·mL-1。进一步分析了细胞的存活率和通透性之间相关性（表1），发现在浓度和赋存时间影响因素的实验中两者显著相关（P<0.05），且相关性较强；而粒径和种类的影响因素试验下两者虽然同样显著相关（P<0.05），但相关性较弱。

图3 不同赋存时间对耐四环素屎肠球菌存活率的影响注：（a） 100 mg·L-1 nTiO2，（b） 100 mg·L-1 nZnO。Fig. 3 Effects of different persistent period on the survival rate of tetracycline resistant Enterococcus faeciumNote: （a） 100 mg·L-1 nTiO2, （b） 100 mg·L-1 nZnO.

表1 细胞的存活率和LDH的产量之间相关性分析Table 1 Correlation analysis between cell survival rate and LDH production

图4 不同种类、浓度、粒径的纳米氧化物及不同赋存时间下与耐四环素屎肠球菌反应后的LDH值 注：（a）不同种类，（b）不同浓度，（c）不同粒径，（d）不同赋存时间；LDH为测定出的乳糖脱氢酶活性值，虚线表示未经纳米氧化物处理的耐四环素屎肠球菌的LDH值。Fig. 4 The LDH value of tetracycline resistant Enterococcus faecium after reacting with nano metal oxides of different types, concentrations, sizes and different storage timesNote: （a） Different kinds, （b） Different concentrations, （c） Different size, （d） Different storage time; LDH indicates the measured lactate dehydrogenase activity value, and the dotted line represents the LDH value of tetracycline-resistant Enterococcus faecium without nano metal oxide treatment.

3 讨论（Discussion）

在nZnO、nCuO和nTiO23种纳米材料中，nCuO的毒性最强，可能是因为nCuO溶解出的Cu2+具有较强的毒性，能够进入细胞导致细胞死亡[27]。在一项针对nZnO、nCuO和nTiO2对酵母菌的毒性研究中，同样发现nCuO毒性最强[28]。相近地，nZnO对耐四环素屎肠球菌也表现出较强毒性，在10 mg·L-1暴露时致死率达30.56%，可能是由于nZnO溶解产生的Zn2+具有细胞毒性导致，在本研究中nZnO在加入浓度为10 mg·L-1时溶解的Zn2+浓度达1.03 mg·L-1。Zn2+被报道可以破坏细胞膜使细胞内容物流出，同时抑制细胞壁的合成，抑制细胞的繁殖和生长，进而使细胞死亡[29]。相比之下，nTiO2的毒性相对较低可能是因为nTiO2溶解性较低，溶出的离子浓度较低。而且相应的离子的毒性低于Cu2+和Zn2+，所以表现出较低的毒性。如徐争启等[30]在研究中报道Ti的毒性系数远小于Cu。此外，nTiO2较弱的毒性可能与其带电性有关。据报道nTiO2表面的电荷值接近中性，不易与表面带负电的耐药细菌结合，因此毒性较低[31]。

在探究浓度对纳米氧化物对耐四环素屎肠球菌毒性的研究中发现，纳米氧化物浓度较低时，毒性随纳米氧化物浓度的升高而加强（P<0.05），这可能除离子溶解外，纳米氧化物本身的毒性也是导致细菌死亡的因素。加入的纳米氧化物浓度升高后与细菌的接触概率提高，以及析出的离子浓度提高。然而，浓度进一步提高后尽管析出的离子浓度可能有进一步提高（如nZnO在浓度为10 mg·L-1时Zn2+析出浓度为1.03 mg·L-1，在浓度为100 mg·L-1时Zn2+析出浓度为12.16 mg·L-1），但是过高浓度的纳米氧化物容易发生团聚，形成的实际粒径远大于低浓度时（如ZnO在浓度为10 mg·L-1时水合粒径为401.80 nm，在浓度为100 mg·L-1时水合粒径为917.38 nm），因此导致纳米氧化物的接触毒性变弱，使纳米氧化物的总体毒性下降。这表明纳米氧化物的粒径对毒性的影响可能是粒子的接触和溶出为金属离子共同作用的结果。

关于粒径对纳米颗粒毒性的影响研究尽管已开展较多，但是没有定论。很多研究认为粒径越小，纳米颗粒的毒性越大[32]，主要是由于粒径越小分散性越好，容易与微生物接触。此外，粒径越小可能有利于金属离子的溶解，因而毒性增大[33-34]。然而，也有研究发现纳米颗粒粒径越大，毒性越大，主要是由于粒径越小在水中越容易团聚，导致毒性降低[35]。本研究发现纳米氧化物毒性随粒径增大先增大后减小的趋势，可能再次验证了纳米颗粒的接触和溶解金属离子同时起作用，即在较小粒径范围时，容易溶解产生离子，但是纳米颗粒易团聚（如粒径为30 nm的nZnO水合粒径为401.80 nm，团聚倍数为13.39），综合表现为粒径越小毒性越小，当粒径范围提高后，纳米颗粒团聚趋势减弱（如粒径为200 nm的nZnO水合粒径为857.49 nm，团聚倍数为4.29），因此毒性增加[36-37]。而粒径进一步增加后，离子溶解减少，纳米颗粒的接触毒性也降低，因此毒性降低。

对于赋存时间对毒性的影响研究发现随着赋存时间的延长，细菌的存活率降低，这可能是因为赋存时间的延长使纳米氧化物溶出的金属离子浓度提高（如浓度为10 mg·L-1的nZnO在0 h的溶解金属离子总浓度为1.03 mg·L-1，在6 h的总浓度为1.62 mg·L-1），因此毒性增强。相近的结果在前人的研究中也被报道，如Ma等[38]研究了纳米氧化锌对大肠杆菌的暴露时间和抗菌率的关系，发现暴露时间越长，纳米氧化锌的抗菌效率越高，因为暴露时间越长溶出的金属离子的浓度在不断提高。

细胞通透性的提高与纳米氧化物的毒性之间的变化趋势尽管存在相似之处，但也有不少情况下偏差较大。这可能是因为同一种纳米氧化物经不同的处理后，其毒性与细胞通透性间存在较好的相关性，说明纳米氧化物作用于细胞先破坏细胞膜使其通透性增大，然后金属离子或纳米氧化物颗粒进入细胞体内使其死亡；而不同种类或粒径的纳米氧化物之间差距较大，造成的通透性变化差异较大。

本研究表明，纳米氧化物在污水处理过程中对耐四环素屎肠球菌表现出较明显的毒性，且毒性受纳米氧化物种类、粒径、浓度和在水中的赋存时间等影响。3种纳米氧化物的毒性大小为nCuO>nZnO>nTiO2；纳米氧化物毒性随浓度和粒径的提高均呈现先升高后降低的趋势；赋存时间越长，纳米氧化物对耐四环素屎肠球菌的毒性越强。从影响机理看，纳米氧化物及其溶解产生的金属离子共同作用，破坏细胞膜，提升了细胞膜的通透性，纳米氧化物和金属离子进入细胞进一步破坏胞内物质，导致细胞死亡。然而，纳米氧化物对耐四环素屎肠球菌的毒性并不必然意味着抗生素抗性风险的降低，抗性基因可能在胞外仍保留活性。尽管纳米氧化物与耐药细菌存在广泛的接触和相互作用的机会，纳米氧化物对耐药细菌的影响在以往的研究中尚未被充分揭示，在未来的研究中需要继续关注。本研究可为阐明纳米材料对耐药细菌的影响作用和机制提供理论和实验支撑。