北京市密云某私采金矿矿洞废水对大型溞的急性毒性研究

李珊，王潇逸，刘军，张雅楠，王元凤,2,*

1. 中国政法大学证据科学研究院，北京 100191 2. 法庭毒物学公安部重点实验室，北京 100191

冶金工业作为一项重要的重金属工业项目，生产流程各成系列，产生的大量废水中含有重金属离子、剧毒氰化物、硫化物和酚等污染物质，是污染环境的主要废水之一。已有研究表明工业废水和城市废水现已成为了环境水体中内分泌干扰物（EDC）的主要来源[1-3]。

根据冶金工艺的不同，冶金工业被分为钢铁工业和有色冶金工业。钢铁工业废水中主要含有酸、碱、酚、重金属及氰化物等有害物质。有色冶金工业又分为火法冶金和湿法冶金2种。相对而言，湿法冶金所排放的废水成分更为复杂且含量更高[4]，其中很多物质的含量明显超过了标准和工艺要求。冶金废水中含有的氰化物、重金属和酚等有毒物质，会对接触的生物造成严重危害，也会对环境造成不可估量的损害。废水中的某些物质虽无毒，但大量积聚就会对水体有害，如排入水体的有机物和无机物。有机物超标，水体会出现厌氧腐败；无机物含量过高，会对水中生物有严重影响，含有氮磷等物质则使水体富营养化，破坏生态平衡。

为了减少冶金废水对生态环境的污染和破坏，废水处理部门和研究人员针对不同成分的冶金废水采用不同方法进行处理。黄龙等[5]提出使用低温热法短流程脱氨技术处理氨氮废水，并将此方法应用到实际废水处理环节中。此方法氨氮去除率高且能耗低，没有二次污染，可实现资源循环利用。薛柯等[6]用斑马鱼胚胎、发光细菌和小鼠L929细胞3种模式生物进行急性毒性实验，检测了厌氧-缺氧-好氧（A2/O）处理工艺对4种行业（生活废水、综合废水、化工废水和制药废水）、6家废水处理厂的总进水和总出水的毒性效应及毒性削减情况。结果显示经过处理后的总出水仍具有一定的综合生物毒性；斑马鱼胚胎的毒性敏感程度整体最高。

大型溞（Daphniamagna）是一种常见的实验室模式生物，因具有对水质敏感、个体小、生活周期短、生长快等多种优点，被广泛应用于环境中各类毒害物质的监测。大型溞已被证明对重金属[7-9]、有机物[10-11]和农药[12-13]等多种毒性物质反应灵敏，可表征急性毒性。谢希琳[14]等通过使用脉冲暴露方式来模拟大型溞在自然环境中的暴露方式，研究了三价砷和五价砷对大型溞的急性毒性。结果显示在多种暴露方式中，三价砷的毒性效应均远高于五价砷；在不同脉冲暴露模式下，脉冲暴露的时间间隔越长，大型溞对砷的耐受性越强。杨京亚等[15]研究了大型溞及斑马鱼在含腈纶废水中的急性毒性和遗传毒性，并对厌氧-好氧工艺对废水毒性的削减能力进行了评价，发现腈纶废水能使斑马鱼肝细胞中的彗星尾矩显著性变长，造成肝细胞DNA损伤。腈纶废水对大型溞也有明显的急性毒性。此外，经处理后废水的遗传毒性仍显著高于阴性对照组。

本研究基于真实环境损害案件，实验中使用大型溞作为指示生物，对北京密云某私采金矿矿洞中发现的废水进行生物急性毒性检测，目的是为相应的案件审判提供技术依据。

1 材料与方法（Materials and methods）

1.1 实验水样

废水样品瓶为1 L蓝色广口玻璃瓶。样品瓶使用前用重铬酸钾溶液浸泡过夜，再用自来水、蒸馏水反复冲洗，倒置晾干。为全面检测矿洞中废水的生物毒性，实验人员在矿洞废水池中设置了5个不同位置的取样点（图1），实验人员于2020年11月9日进入矿洞进行水样采集，将采集的水样装入样品瓶，废水应充满样品瓶，防止可能含有的挥发性污染物损失。分别标注为水样1～5，封口膜密封后放入4 ℃车载冰箱带回实验室后立即放入4 ℃冰箱备用。

图1 水样采集位置示意图Fig. 1 Schematic diagram of sample collection location

实验水样无味，呈黄色透明状，取回后在实验室对其进行酸碱性检测，结果显示上述5个水样全部为弱碱性（pH约为9.5）。经预实验测定发现，未经稀释的水样中含有具有挥发性的物质，且挥发性物质可导致大型溞死亡。由本实验背景案件信息可知，废水由氰化法私采金矿产生，根据其开采工艺推断废水中应含有氰根离子和金属元素，因此依据《水质氰化物的测定容量法和分光光度法 第二部分 异烟酸-吡唑啉酮分光光度法》（HJ 484—2009），开展了废水中总氰化物的检测，检测结果如表1所示；依据《水质65种元素的测定 电感耦合等离子体质谱法》（HJ 700—2014），使用ICP-MS方法进行金属元素检测，水样中的主要金属成分及含量如表2所示。

1.2 受试生物与培养条件

实验选用的大型溞已在本实验室经过50代以上的单克隆培养及驯化。大型溞以小球藻为食，实验过程中，每2天喂食一次，喂食浓度约为1.5～3.6×106cell·mL-1，急性活动抑制实验过程中不喂食，培养过程中每天对新生幼溞进行一次筛选，以保证幼溞的一致性，实验时在显微镜下挑选体型饱满，身体健康的大型溞所产的出生24 h内的幼溞进行毒性试验。

大型溞在人工智能光照培养箱（Percival-DR-36VL, PERCIVAL科技公司，美国）中培养，温度为（23±1） ℃，光暗周期为16 h L: 8 h D。大型溞养殖水为曝气的自来水（曝气时间>96 h），经测定，该水的pH为8.0±0.2，氧气含量≥4 mg·L-1；总有机碳<2 mg·L-1；游离氨<1 μg·L-1；游离氯<10 μg·L-1；硬度为（210±22） mg·L-1（以CaCO3计），电导率<4×10-2S·m-1。

表1 废水水样中总氰化物检测结果Table 1 Detection results of total cyanide in sewage samples

表2 废水水样部分金属元素的检测结果Table 2 Detection results of metal elements in sewage samples （mg·L-1）

1.3 实验条件及方法

急性毒性实验参考《化学品 溞类急性活动抑制试验》（GB/T 21830—2008）[16]和《水质 物质对溞类急性毒性测定方法》（GB/T 13266—1991）[17]。

实验中所用养溞容器均为250 mL玻璃烧杯，每次使用前用洗衣粉、自来水和蒸馏水依次冲洗并经高压蒸汽灭菌锅灭菌。在每个处理后的烧杯中放置200 mL培养液，饲养20只大型溞。

将每个水样设置8个实验组和1个对照组，对照组内不添加水样，每个实验组设置3个平行，实验组为水样稀释液，稀释倍数分别为原浓度的50倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1 600倍、3 200倍、6 400倍和12 800倍，浓度公比为2，稀释方式为梯度稀释。

重铬酸钾设置了7个实验组和1个对照组，实验组浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.6和3.2 mg·L-1，浓度公比为2，这些浓度由1 g·L-1的母液稀释为100 mg·L-1后配制而成。所有浓度均设置3个平行。

整个实验过程中实验人员需及时观察并记录大型溞的运动与死亡情况。

1.4 实验质量控制

设置了对照组，用未添加水样的饲养水作为对照，此外还设置了重铬酸钾溶液组来验证大型溞的敏感性。每组实验实验前和实验期间都进行水质测定，以分析实验过程中温度、pH和溶解氧结果与实验前相比有无明显差异。

2 结果（Results）

2.1 大型溞形态变化

在大型溞培养24 h时，对各实验组和对照组的形态进行观察并记录。通过观察发现，对照组中的大型溞能正常生长，肢体完好（图2（a））；使用1～5号水样直接培养大型溞24 h后，实验组的大型溞均出现心跳缓慢、肢体残缺、腐烂严重且眼部弥散，胸肢出现间歇式抽动、缺损，尾刺弯曲，较为严重的身体还会发生形变，发生较大的畸形变化；重铬酸钾溶液中培养24 h后，大型溞身体发生形变，但尾刺未发生弯曲，部分溞体内有气泡状组织或溃烂，生命状态与水样处理组比相对较好，心跳频率较快，但胸肢摆动仍然不规律。图2（b）～（d）展示了部分畸形或形态严重改变的大型溞。

图2 对照组大型溞（a）和畸形或形态严重改变的大型溞（b）～（d）注：（b）大型溞的眼部弥散；（c）大型溞产生了严重形变；（d）大型溞胸肢变形严重，尾刺弯曲，体内有气泡状组织。Fig. 2 Normal Daphnia magna in control group （a）, deformed or severe morphological changed Daphnia magna （b）～（d）Note: （b） Daphnia magna’s eyes are diffused; （c） Daphnia magna is severely deformed; （d） Daphnia magna’s thoracic limbs are severely deformed, its tail spines are bent, and there are bubble like tissues in its body.

2.2 大型溞活动受抑制数量

对各实验组和对照组培养24 h及48 h后活动受抑制的大型溞数量进行统计，5个水样的大型溞活动受抑制率如表3和表4所示。

分析结果发现，大型溞在稀释50倍的水样中培养24 h时，已开始全部受抑制。当水样浓度稀释倍数达到12 800时，水样1、2、3中的大型溞完全不受抑制。

培养48 h后，当水样浓度稀释100倍时，水样3和水样5中的大型溞有少部分未受抑制，随着水样稀释倍数的不断增大，抑制率明显降低，当稀释倍数达到12 800时，水样1、3、5中的大型溞完全不受抑制，能够生存并自由活动。

对比培养24 h和48 h各浓度水样中的大型溞活动受抑制率数据可知，水样为同一稀释倍数时，培养48 h时大型溞的活动受抑制更明显。

2.3 废水水样对大型溞的急性毒性

5个水样的剂量-效应曲线如图3，经计算可得大型溞培养24 h和48 h后半数被抑制时水样的稀释倍数，如表5所示。

表3 培养24 h后大型溞活动受抑制率Table 3 Inhibition rate of Daphnia magna activity after 24 h culture （%）

表4 培养48 h后大型溞活动受抑制率Table 4 Inhibition rate of Daphnia magna activity after 48 h culture （%）

对比实验24 h和48 h数据，发现水样1的稀释倍数都相对较大，这说明水样1的毒性相比其他4个水样更大。培养48 h的稀释倍数均大于培养24 h的稀释倍数，说明随着培养时间变长，废水的毒性有不断变大的趋势。

表5 大型溞培养24 h和48 h后半数抑制时水样稀释倍数Table 5 Dilution ratio of sample at 50% inhibition after 24 h and 48 h culture of Daphnia magna

根据《化学品分类和标签规范 第28部分：对水生环境的危害》（GB 30000.28—2013）[18]中危害水生环境物质的分类标准规定，48 h的甲壳纲类生物动物的LC50≤1 mg·L-1，可认定为急性类别Ⅰ。培养48 h时，1号废水水样中总氰化物EC50为0.07 mg·L-1，2号水样中总氰化物EC50为0.07 mg·L-1，3号水样中总氰化物EC50为0.59 mg·L-1，4号水样中总氰化物EC50为0.18 mg·L-1，5号水样中总氰化物EC50为0.45 mg·L-1，均<1 mg·L-1，故本案所有废水水样的急性毒性类别均为急性类别Ⅰ。

3 讨论（Discussion）

笔者研究了密云某私采金矿矿洞中废水对大型溞的急性毒性，以48 h-EC50作为判定指标，5处水样按毒性强弱排序为：水样4、水样1、水样2、水样5和水样3。根据取样点位置，3～5号水样均为废水池右侧区域采取，急性毒性应相近，但结果显示水样4毒性差异较大，猜测这是由于废水长时间放置，经过了沉淀和分层过程，导致毒性物质分布不均匀。

图3 5个水样的剂量-效应曲线注：EC50（24 h）指培养24 h的大型溞半数抑制时水样稀释倍数；EC50（48 h）指培养48 h的大型溞半数抑制时水样稀释倍数。Fig. 3 Dose-effect curve of five samplesNote: EC50（24 h） refers to the dilution ratio of sample when half of Daphnia magna is inhibited after culture for 24 h；EC50（48 h） refers to the dilution ratio of sample when half of Daphnia magna is inhibited after culture for 48 h.

水样1取自废水池左侧较浅的区域，该位置水面面积大且深度较浅，猜测在长期放置过程中废水中的水分蒸发较其他区域明显，因此水样1毒性略大。

目前关于大型溞急性毒性的研究大多以大型溞的死亡作为评价依据[19-22]，但有研究表明LC50不能有效反映环境中的污染物真实含量和毒性[10]。因此，本研究选择了活动抑制率和形态行为观察2个指标，能更直观更灵敏地反馈水样的生物急性毒性情况。

本研究实验方法参考了《化学品 溞类急性活动抑制试验》（GB/T 21830—2008）和《水质 物质对溞类急性毒性测定方法》（GB/T 13266—91）2个国家标准。虽后者适用范围中包括工业废水，但发布日期为1991年，目前尚无更新版本；且5个废水水样虽成分复杂，但均为冶金过程中产生的化学物质。因此，研究人员综合参考了上述2个标准进行研究。

根据本实验背景案件信息，实验中的废水水样为金矿采矿后的废液，应为多种物质的混合物，根据工艺推断其中应含有大量的氰根离子和金属元素，生物急性毒性应为多种毒性物质的混合效应。最终结果无法单独使用其中某一种物质的EC50表示，因此采用了稀释倍数作为替代，表示相对毒性的高低。当大型溞半数抑制时，水样的稀释倍数越大，原水样的生物毒性越大。

在《水质 物质对溞类急性毒性测定方法》（GB/T 13266—91）中，废水也是经过了与蒸馏水配比后才进行毒性试验，即同样对原水样进行了稀释。为更加全面地证明本研究中废水水样的生物毒性，研究人员对水样中的主要毒性物质——总氰化物和重金属进行了检测，并增加了培养24 h的结果统计。

废水中的总氰化物和金属元素定量检测结果显示，废水中除含有较高的总氰化物外，还有含量较高的Ag、Au、Cu、Co、Fe、K、Mg和Zn等主要金属元素。国内研究较多的为Zn[23-24]、Cu[24]元素对大型溞的影响，陈丽萍等[23]通过实验得出Cu和Zn对大型溞的48 h-EC50值分别为0.0356 mg·L-1和0.218 mg·L-1。本研究检测结果中Cu和Zn的含量均明显高于上述值，因此水样中除总氰化物外其他金属也会对大型溞的生存有影响，多种金属的混合溶液对大型溞的毒性作用与各种金属各自对大型溞的毒性作用之间的关系尚不明确，有待进一步研究。

在实验过程中，观察对照组及重铬酸钾组中大型溞的活动情况，对照组中大型溞的活动抑制率<10%，重铬酸钾组的24 h-EC50值在0.6～2.1 mg·L-1范围内，符合规范要求，大型溞对化学品的敏感性能达到实验要求。实验前和实验期间的水质测定结果显示，温度变化<1 ℃，溶解氧结果与实验开始相比无明显差异，>3 mg·L-1。因此检测及分析结果有效可信。

本实验基于真实刑事案例，对于案件中的证据提供有较为严苛的时间要求，若采用大型溞的慢性毒性实验，则会延误后续的执法与审判。同时，本研究中急性毒性实验数据已满足相关委托部门要求，故未开展大型溞的慢性毒性实验。

综上所述，本研究从形态行为、活动抑制率2个个体层次对密云私采金矿矿洞中废水的生物急性毒性进行了检测。急性毒性实验结果显示，5个采样点采集的水样均严重抑制了大型溞的生存及活动，由此可知，私采金矿的行为会对自然环境产生极其恶劣的影响。因此，应进一步加强对金矿开采后产生废水的加工和处理并严格管控工业废水的私自排放。