胰岛素自身抗体临床检测应用局限及对策研究进展

2022-11-22陈煦阳顾卫琼

诊断学(理论与实践) 2022年1期

陈煦阳，顾卫琼

（上海交通大学医学院附属瑞金医院内分泌代谢科上海市内分泌代谢病研究所国家代谢性疾病临床医学研究中心，上海 200025）

胰岛素自身抗体 (Insulin Autoimmune Antibodies，IAA)是机体针对胰岛素产生的特异性抗体。作为自身免疫反应产物，其可导致糖尿病发生，或导致体内血糖波动及外源性胰岛素效价降低。目前，其临床主要应用于以下几个方面。首先，多数1 型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)和T1DM 前期的患者，其体内可检测到IAA，故临床可采用IAA 检测来进行疾病诊断和风险分层。但在发病机制方面，目前研究结果倾向于IAA 是胰岛自身免疫炎症的旁观者。其次，IAA 检测可用于辅助诊断胰岛素自身免疫综合征(insulin autoimmune syndrome，IAS)。该病以患者无明显诱因下出现频繁发作的低血糖为临床特征[1]，推测是IAA 可逆性结合循环胰岛素从而影响了体内胰岛素代谢速率和生物学效能。此外，IAA 检测还可用于“外源性胰岛素抗体综合征(exogenous insulin antibodies syndrome，EIAS)”[2]的诊断。部分糖尿病(无论1 型或2 型)患者在使用外源性胰岛素注射液后，会有可能伴发循环IAA 水平持续升高。由此导致的外源性胰岛素临床效价降低而出现胰岛素抵抗，命名为EIAS。

在不同疾病中，IAA 所产生的生物学效应不尽相同，所引发的血糖浓度改变程度及规律也截然不同。IAA 抗体因产生病因或其他机制而存在不同的亚群，目前检测方法无法甄别其克隆亚型及区分其抗原成分(胰岛素自身分泌或外源性胰岛素制剂)，故在临床诊断和治疗时存在很大的局限性。本文就IAA 检测在以上相关疾病中应用出发，就其亚群分型鉴定相关的免疫学研究进展，就亲和力、同种型和抗原表位3 种分析法进行总结，为临床诊疗工作提供实验室检测思路。

IAA 检测的临床应用

目前IAA 检测主要应用于T1DM 的诊断、风险预测和IAS 及EIAS 的诊断。在不同疾病中，IAA 的生物学效应各不相同。

一、预测罹患T1DM 的风险

这是IAA 应用最广泛和最成熟的领域。IAA 联合其他糖尿病相关性自身抗体检测(如抗谷氨酰胺脱羧酶抗体、抗锌转运体8 抗体等)，是诊断T1DM 依据之一[3]。研究认为，T1DM 相关自身抗体(包括IAA)是自身免疫炎症的标志物，不是疾病诱因或未直接参与T1DM 的发病。但与其他自身抗体相比，IAA 突出优点是出现最早，且早于糖尿病发病。这在多个T1DM 高风险患儿的纵向队列研究观察，包括DAISY[4]、BABYDIAB[5]以及DIPP[6]等的研究中得以确认。基于这个特点，在预防T1DM 的药物临床试验中，IAA 常作为T1DM 前期的胰岛自身免疫炎症标志物，用于筛选受试者[7]。

二、IAS 诊断

IAS 是一种罕见的自身免疫性疾病，由IAA 直接致病。患者临床表现为自发性频繁发作的低血糖和(或)高血糖事件(以低血糖为主)、血清高滴度IAA 水平、高胰岛素血症，及伴随高血糖向低血糖转化时血清胰岛素-胰岛素抗体复合物的检出。IAS 的发病机制尚不清楚，目前首先考虑特定原因，包括巯基药物的使用、血液疾病以及病毒感染等所诱发，或伴发与其他自身免疫性疾病而促发免疫反应，导致循环内存在高水平IAA。IAA 与胰岛素受体竞争结合循环中的胰岛素，阻止胰岛素发挥生物学功能，这会促使胰岛β 细胞过量分泌胰岛素。IAA 结合胰岛素后，在血糖阈值(4.5 mmol/L，此时体内胰岛素分泌减少或停止)以下，会解离释出有生物学功能的游离胰岛素，由此会导致严重的血糖波动，即由餐后血糖先高后低的“跳水式”变异现象[1-2]。

IAS 的诊断目前尚缺少金标准。2 h 禁食试验确诊的高胰岛素性低血糖症患者(有与胰岛素分泌水平波动相一致的高C 肽、高前胰岛素血症)，在严格排除其他病因，特别是在排除药源性病因(包括外源性胰岛素制剂的使用和胰岛素促泌剂的滥用、误用等)的前提下，如伴有IAA 阳性，则可诊断为IAS。如在后续诊治过程中，患者的血糖波动在去除诱因，如停止含巯基药物的使用，或规范治疗血液疾病获得缓解等后，表现出自愈倾向，则可成为诊断IAS 的进一步佐证[2]。因IAA 是IAS 的特征性标志物，IAA 检测现已成为低血糖症病因诊断中的常规检验项目之一[1]。

三、EIAS 诊断

外源性胰岛素制剂，包括重组人胰岛素和胰岛素类似物，可诱导IAA 异常增多，其可与自身胰岛素可逆结合，进而影响胰岛素药效及药代学参数。临床上EIAS 患者主要表现为不同程度的胰岛素治疗效价减低(胰岛素抵抗)，和难以控制的高血糖以及偶发的低血糖事件。值得注意的是，虽然发病原因同IAS，均为因IAA 出现而导致的疾病，但EIAS患者中很少出现频发的低血糖事件。糖尿病患者如在使用外源性胰岛素的过程中出现不明原因的严重血糖波动，或者予大剂量胰岛素仍旧难以控制高血糖的情况下，IAA 检测高水平阳性，临床上可诊断为EIAS。此时，应及时给予患者针对性处理，如替换胰岛素种类或给予胰岛素增敏剂等[8]。

虽然随着猪、牛胰岛素逐步退出市场，纯化和重组人胰岛素制剂的使用已显著降低了EIAS 的发生率。但是，EIAS的发生仍可能与胰岛素种类以及特定给药方式(持续皮下胰岛素输注或行多次注射的强化胰岛素治疗方案)有关[8]。因而，EIAS 仍普遍存在于现阶段的糖尿病人群中。介于国内尚未有可靠数据反映EIAS 真实发病率，在糖尿病患者的随访中，是否需要常规纳入IAA 抗体检测还有待讨论。

现有IAA 检测在临床应用中存在的问题

目前临床上普遍使用的实验室IAA 检测手段包括依赖以胰岛素和(或)胰岛素抗原肽作为探针的放射性受体配体结合检测法、酶联免疫吸附试验法和电化学发光法[9]。但这3 种检测方法均不能有效区分T1DM、IAS 和EIAS 疾病中生物学效应迥异的IAA 抗体亚群(克隆)，且在罹患其他自身免疫疾病个体以及正常人群中也可能检出IAA，但他们无上述血糖异常表现[10]。当前IAA 检测主要存在以下问题。

一、检测不能区分针对自身或外源性胰岛素抗原的IAA

IAS 和EIAS 均较罕见，其诊疗标准和规范尚处于研究和讨论过程中，两者的临床症状变异大且互有交叉。以“低血糖”首诊伴有IAA 阳性的患者，需要在IAS、EIAS、滥用或过量外源性胰岛素注射的正常人、糖尿病患者间作鉴别，而有无胰岛素治疗史是疾病鉴别诊断的关键点。但在实际临床工作中，这类问诊资料可能会面临患者隐瞒、遗忘或无法提供(患者低血糖昏迷状态)等问题。

与此同时，T1DM 患者不排除合并EIAS 的可能，患者血液循环中既存在作为胰岛自身免疫炎症标志物的IAA，又存在外源性胰岛素诱导的IAA，以及包括不明原因诱发的IAA，这显著增加了临床诊断和治疗过程中分析的难度[2,11]。国际上已经有此类病例一例报道[12]。该病例在初期IAA 检测阳性，作为T1DM 的诊断依据，但EIAS 被忽视，以至于后期患者发生酮症酸中毒后才考虑到EIAS 的诊断。因此，当前IAA 检测技术限制了临床工作者对糖尿病患者血糖异常(难治高血糖、频发低血糖、高低血糖之间的频繁转化)病因的正确判断和反应。

二、IAA 检测对T1DM 发生风险的预判能力存在不确定性

如前述，IAA 阳性是T1DM 的风险预测指标，但研究同样也观察到，IAA 阳性者中存在不进展为T1DM 的情况。如在糖尿病预测和预防项目(Type 1 Diabetes Prediction and Prevention study，DIPP)[6]中，在69 例IAA 检测阳性的T1DM一级亲属患儿中有42 例(60.9%)从出生到15 岁都未被诊断为T1DM，提示IAA 预测T1D 发生风险的作用还存在较大的不确定性，故细分IAA 亚型十分重要。

值得庆幸的是，已经有一系列免疫学研究证据表明，不同疾病状态下IAA 在亲和力、同种型及抗原表位识别等层面显示为多克隆，并且拥有疾病相关的异质性特征。研究显示，可以依据这些特点对IAA 做进一步的分型鉴定。

IAA 分型鉴定的相关研究进展

一、IAA 亲和力分型

IAA 亲和力研究是糖尿病自身抗体研究领域中的一个切入点。竞争性结合试验是亲和力测定的常规方法。采用不同梯度浓度的人胰岛素与定量125I 标记胰岛素竞争结合血标本中的IAA，得到相应的Scatchard 竞争曲线，并通过软件计算求得人源胰岛素竞争碘标记胰岛素的半数抑制浓度(IC50)和碘标记胰岛素的平衡离解常数(Kd 值)。Kd 值的倒数(L/mol)即为亲和力的大小，而曲线在纵轴上的截距(mol/L)可反映待测抗体的相对结合容量。亲和力检测可将IAA 按照亲和力差异来定性分群，用于以下临床应用。

1.细分IAA 克隆从而预测T1DM 风险：多数研究结果提示单个个体IAA 抗体群中存在高、低亲和力两群混杂的现象，当前针对个体间差异的分析集中于高亲和力群的动力学参数。来自BABYDIAB 队列的56 名T1DM 患者子女的IAA 亲和力研究表明，在随访期间进展为多个自身抗体阳性的儿童，其IAA 的平均亲和力比保持单一IAA 阳性或IAA最终转阴的儿童高出100 倍之多，且个体IAA 亲和力在多次随访间相对稳定，提示亲和力测定具有预测多抗体阳性乃至T1DM 的价值。此外，研究还发现高亲和力与HLA DRB1*04 相关，其与抗体首次出现的年轻年龄呈正相关等[13]。

2.区别针对自身与外源性胰岛素抗原的IAA：IAS 患者的IAA 抗体群在亲和力分析中同样表现为两群多克隆模式，极少有单克隆即亲和力趋近均一的情况。有研究比较IAS 患者与EIAS 的IAA 亲和力曲线，发现IAS 相关的IAA克隆具有低亲和力以及非常高容量的特点，且在纵向观察中发现，随着疾病的缓解，IAA 亲和力升高而容量减小[14-16]。虽然，临床上可对IAA 抗体进行亲和力测定和分析，以进一步确定其在疑似IAS 和(或)EIAS 个体中的潜在病理作用。但由于该方法目前存在可重复性差、操作繁琐、放射性暴露等问题，在技术应用上仍具有较大的挑战性。

二、IAA 同种型

同种型层面，IAA 重链普遍存在形式为IgG 和IgM 类球蛋白[17]。无论是T1DM 高风险儿童、新诊断的T1DM 还是经胰岛素治疗后的糖尿病患者(EIAS)或者IAS 患者，在他们血清中均稳定表达IgG 类IAA[1,8]。

1.预测T1DM 风险：有研究发现，在T1DM 患者后代中IAA 也主要为IgG1，极个别以IgG4为主，但后者的存在与临床疾病风险可能无关[19]。Achenbach 等[5]随访了T1DM 患者的180 例非糖尿病的一级亲属，随访中180 人发病，依据他们自随访起的第一份IAA 抗体阳性血清的血清学特征(包括各类自身抗体的同种型特征)，建立了4 个T1DM 风险模型。其中，以胰岛素瘤相关2 型自身抗体(insulinoma associated-2 autoantibodies，IA-2A)滴度>阳性血清的第25 个百分位；IgG2或IgG4IA-2A 亚类阳性；IgG2、IgG3或IgG4IAA 亚类阳性，这3 个风险因素按照无风险因素及同时含1、2、3 个风险因素建立的A、B、C、D 风险模型，结果提示较单纯按照自身抗体种类数量划分的风险模型，该模型显著改善了风险分层(P<0.000 1)。较其他未使用IAA 亚类为标准者，该模型提供了全面的风险分区(5 年和10 年进展为T1DM 的风险，A 类为7%和20%，B 类为19%和47%，C 类为54%和85%，D 类为89%和100%)。

2.区别内源性与外源性IAA：针对T1DM 个体的同种型研究表明，IAA 克隆群存在亚类优势，各亚类浓度关系呈IgG3>G1>G2>G4，即内源性IAA 以IgG3为主，而接受动物或人胰岛素治疗后的个体，其IgG3会向-IgG1转化[20]，即外源性IAA 以IgG1为主。

三、抗体表位分析

1.预测T1MD 风险：以胰岛素肽段多种抗原表位作为潜在的免疫学探针，提供了进一步细分IAA 的手段。在近期发病的T1DM 患者以及T1MD 高危亲属的新鲜外周血淋巴细胞中，已经证实存在胰岛素B 链9-23 位抗原肽(InsB9-23)反应性T 细胞[19]。进一步分析对HLA-DQ8 分子(与高T1DM风险相关联)所递呈的胰岛素B 链表位作出应答的CD4+T细胞亚群(InsB10-23：DQ8 四聚体+CD4+T 细胞)，结果发现，携带DQ8 等位基因的T1DM 患者较非糖尿病个体拥有更高比例的四聚体+CD4+T 细胞。不仅如此，研究还发现，四聚体+效应性记忆T 细胞的数量可能与患者IAA 的滴度相关[21]。Achenbach 等[5]的研究发现，所有44 名具有高亲和力IAA 的受试者都具有胰岛素A 链8-10/13 位抗原肽InsA8-10/13依赖性的IAA 结合模式，即如该位点发生变异，IAA 与胰岛素(人A13trpB28lysB29pro 胰岛素)亲和力显著减小，同时存在与胰岛素原发生交叉反应。相比之下，大多数低亲和力IAA可与胰岛素B 链C′端残基结合，不与胰岛素原结合。这个发现与T1DM 患者早期出现胰岛素(原)暴露的推论相一致，并提示同时具备高亲和力及与胰岛素原反应性的IAA，可用于识别T1DM 风险最高的儿童。此外，在IAS 中，有研究报道位于胰岛素A 链的抗原表位8TSICSLYQLE17与IAS发病相关联的DRB1*04：03 分子10IxxLxQ15模序有高度亲和力[22]。

2.识别IAA 与T1DM 是否相关：Devendra 等[23]采用噬菌体展示技术，从噬菌体展示肽库筛选出分别能与IAS 及初诊T1DM 患者的IAA 各自特异结合且符合胰岛素分子序列的多肽段。其中，与IAS 患者的IAA 结合的一个多肽段，并未与T1DM 患者的IAA 结合。反之，与T1DM 的IAA 高度亲和的一个多肽段也未与IAS IAA 结合。该研究是区分T1DM 相关性与非糖尿病相关性IAA 的一次成功尝试。