非洲猪瘟病毒主要蛋白研究概述

赵向红

（山东省菏泽市定陶区畜牧服务中心，山东菏泽 274100）

非洲猪瘟疫情于1921年在肯尼亚被首次报道，1957年传入西欧及拉美国家后才开始引起世人的关注，2007年以来，疫情在多个国家相继发生，2017年3月，俄罗斯远东地区发生的非洲猪瘟疫情与我国仅距1 000 km。2018年沈阳市沈北新区首次发现国内非洲猪瘟病例，此后，疫情在我国31个省份快速点状发生，至2019年底，我国共报告非洲猪瘟疫情160余起，捕杀、销毁生猪超过120万头，对国内养猪业的健康发展构成了严重威胁。科研工作者通过对非洲猪瘟病毒的研究，已经发现一些与病毒致病相关的蛋白，通过对已知蛋白的解析，以期为非洲猪瘟疫情防控提供参考。

1 非洲猪瘟病毒

非洲猪瘟病毒（ASFV）是唯一的双股虫媒大核DNA病毒，形态呈对称的二十面体，直径约200 nm，碱基数约为17～19万个，其中包括开放阅读框151～167个，编码多种蛋白质，包括结构蛋白和免疫调节蛋白。病毒核内膜为单一脂膜，含p54、p22、p30等蛋白，核衣壳主要为结构蛋白p72，目前仅研究出68种结构蛋白的功能，其中参与复制的蛋白约30个，其余为参与诱导凋亡、破坏凝血、病毒吸附、免疫逃逸等，大多数ASFV基因的功能还是处于未知状态，使新的疫病防控策略受到严重制约。因此，深入研究ASFV的致病基因成为当前研究的热点。

2 非洲猪瘟病毒研究现状

2.1 检测技术

非洲猪瘟疫情给养猪业带来的损失较大，目前仍没有疫苗可以防控，只能依靠完善的生物安全防控来阻断疫情发生。在防控非洲猪瘟疫情方面，主要通过对生猪、猪场内部环境、工作人员等的早期病毒检测来进行早期清除。为了精确监测非洲猪瘟病毒，对病毒的检测技术要求也较高，我国于2020年12月14日由国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会共同发布了《非洲猪瘟诊断技术》[1]（GB/T 18648-2020）新版国家标准，代替GB/T 18648-2002，并于2020年12月14日正式实施，新标准规定了非洲猪瘟的临床诊断和实验室诊断方法。

非洲猪瘟的实验室诊断方法，从被检靶标物质的分子水平上可以分为3大类，即核酸检测法、病毒检测法和抗体检测法。其中，核酸检测法是指检测ASFV的一段编码为p72的蛋白基因序列，包括普通PCR法、荧光定量PCR法和荧光RAA法。病毒检测法主要利用高敏荧光免疫分析法和夹心ELISA抗原检测法检测靶标完整的病毒颗粒。核酸和病毒检测方法中任何一种检测阳性，均可诊断为ASF病例；但当检测结果不一致时，服从荧光定量PCR法和荧光RAA法中的任何一种阳性结果。抗体检测法中被检病毒的结构蛋白抗体为p54和p30特异性抗体，包括间接ELISA抗体检测法、阻断ELISA抗体检测法和夹心ELISA抗体检测法3种酶联免疫吸附测定法和间接免疫荧光法，任何一项检测阳性，均可诊断为抗体阳性；但当检测结果不一致时，所有检测结果服从间接免疫荧光法。

ASF病原检测简单易操作[2]，但耗时较长，还常因一些人为因素影响结果，不适宜做现场检测。实验室现行的核酸检测方法，优点是时间短、灵敏度高，但对操作的环境条件（如温度、湿度等）要求严格。胶体金免疫层析法、酶联免疫吸附法等血清学检测技术利用抗原—抗体结合物的检测，灵敏度高、检测速度快，易于观察、特异性强，但有制备抗体时间长、成本高、不稳定的缺点。操作简便快捷、成本低廉、结果高效准确及多种诊断方法联合应用将是今后疫病诊断的发展方向。

2.2 病毒研究

由于非洲猪瘟疫情在国内的扩散和蔓延，防控和净化将是未来一个时期猪场的重点工作，快速、科学的早期诊断技术对控制和预防非洲猪瘟非常重要。目前的研究表明，ASFV较好的抗原表位蛋白产生的抗体滴度高，维持时间长，全球对ASFV研究大多集中在p22、p30、p54、p72、CD2v等结构蛋白方面。

2.2.1 关于p22蛋白

p22是非洲猪瘟病毒感染后早期产生的主要结构蛋白，位于ASFV颗粒的内膜和感染细胞的表面，能被非离子去污剂从病毒表面溶解释放。有研究表明[3]，非洲猪瘟病毒p22可以与参与不同细胞通路的几种宿主蛋白相互作用，这些通路有助于病毒感染过程的内吞作用，与非洲猪瘟病毒体外和体内复制过程中的几个关键功能有关。但是，p22基因缺失不会影响ASFV的复制及病毒毒力。还有研究表明p22同时可以诱导猪产生体液免疫及细胞免疫。颜世君等[3]利用某杆状病毒表达系统表达非洲猪瘟病毒p22蛋白，制备抗p22蛋白单克隆抗体，成功得到可溶性的重组p22蛋白，鉴定结果表明，重组p22蛋白可以特异地与非洲猪瘟病毒阳性血清反应，它的研究将为亚单位疫苗及诊断试剂开发提供一定的帮助。

2.2.2 关于p30蛋白

P30蛋白是最具抗原性的蛋白之一，常在感染后的2～4 h表达，12 h后合成减少，能诱导中和抗体的产生，在整个感染期都能检测到，是ASFV重要的结构蛋白。我国新修定的ASFV检测标准中，检测时的包被抗体是P30蛋白单克隆抗体，酶标抗体是辣根过氧化酶标记的P30蛋白单抗[4]，这种检测方法操作简单，可降低假阳性风险，广泛应用于血清学的检测。

2.2.3 关于p54蛋白

p54蛋白是病毒入侵猪体后表达的早期膜蛋白，位于病毒的内囊膜，也是研究较多的蛋白之一，免疫原性较好，结构保守，在机体内产生时间早、持续时间长，在病毒的吸附和入侵中具有重要作用。p54蛋白可直接与动力蛋白结合，形成病毒跨膜结构域，实现病毒在胞质内运转。可以根据p54蛋白特性建立一系列非洲猪瘟病毒的ELISA检测方法，如曹琛福等[5]基于p54蛋白建立了阻断ELISA抗体检测法，也可以制作基于p54蛋白的单克隆抗体的竞争性酶联免疫吸附试验（cELISA）。p54蛋白能引发强的IgG免疫应答，能检测到IgG反应又能检测到IgM，戴建华等[6]建立了基于p54蛋白的非洲猪瘟抗体胶体金的检测方法，且该方法快速实用。同时，研究结果表明建立的胶体金试纸条能作为非洲猪瘟抗体的快速检测方法，可用于大规模流行病学调查和无症状感染猪的筛查。

此外，P30蛋白和p54蛋白在非洲猪瘟病毒感染过程中具有相似的作用，常将二者联合用于研制亚单位疫苗，同时也是DNA疫苗的靶标抗原。如Sanna等[7]利用p30蛋白和p54蛋白研发的非洲猪瘟疫苗的保护率有50%，高于任何用p30蛋白（疫苗保护率0）或p54蛋白（疫苗保护率0）制备的疫苗。

2.2.4 关于p72蛋白

P72蛋白产生在病毒感染后的晚期，其免疫原性好、保守性较强，是病毒主要的核衣壳蛋白，具有高度抗原性和免疫原性，常常用于诊断和疫苗研制[8,9]。如王彩霞等[10]以抗ASFV p72蛋白的特异性单克隆抗体为检测抗体，建立了特异性检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。Borca等[11]利用人胚胎肾细胞表达的 ASFV B646L（p72）制备的亚单位疫苗，免疫猪后发现抗原蛋白能够刺激机体产生体液免疫反应。Lokhandwala等[12]构建了表达p72的重组腺病毒表达载体疫苗，使用该疫苗免疫猪只后，发现疫苗能够诱导猪机体产生高水平的特异性体液，诱导细胞免疫应答和细胞毒性T淋巴细胞反应。

2.2.5 关于CD2v蛋白

CD2v蛋白作为非洲猪瘟病毒的外膜糖蛋白，由402个氨基酸构成，它的结构类似于T淋巴细胞表面黏附受体CD2，因为猪红细胞表面有CD2受体，因此，ASFV极易被吸附在红细胞表面，协助红细胞结合到感染细胞，与胞外病毒粒子一起促进病毒扩散。CD2v蛋白的C端能帮助病毒定位，促进病毒复制，增加ASFV在宿主体内的传播，王曼等[13]研究发现CD2v蛋白可以抑制淋巴细胞增殖，参与病毒的复制与传播和免疫逃逸机制。CD2v蛋白结构和功能的解析促进了它的应用研究，是目前ASFV疫苗研究的热点，以CD2v为靶点研制的减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗和病毒载体疫苗均有问世，且具有较大的开发前景。

2.2.6 核酸适配体

近年来，由于核酸适配体成本低、稳定性好，常用作病毒的体外筛选，且在诸多领域均有关注。Spinach是一种类似增强绿色荧光蛋白的核酸适配体，该核酸适配体能够与荧光染料结合而产生荧光，且细胞通透性强，是目前研究DNA和RNA体外组装的主要染料指示剂。韩程程等[14]以非洲猪瘟病毒的编码保守蛋白p54的基因序列片段为检测目标，结合点亮Spinach RNA适配体的开关功能，运用Spinach—p54的嵌合式RNA适配体，特异地结合目标序列并产生荧光，实现了在RNA水平上对非洲猪瘟病毒的快速检测。

除上述几种非洲猪瘟病毒的热点蛋白外，病毒的A104R、B602L和K205R等基因[15]也都可作为靶抗原，用于疫苗的研制，但由于细胞的免疫保护率数据不足影响了疫苗的研发。深入探索ASFV保护性抗原与现有病毒多样性之间的关系，有助于亚单位疫苗的研发。

3 结语

非洲猪瘟病毒已经在我国形成了较大范围的污染，防控和净化将是一个漫长的过程。扑杀感染猪只和生物安全措施的防控作用较有限，目前亟需安全有效的疫苗控制非洲猪瘟疫情。但是人们对ASFV的免疫机理和免疫逃逸机制的认识和研究还有一定的局限性，阻碍着疫苗的研发进程。此外，非洲猪瘟病毒在长时间流行和传播过程中存在毒力减弱趋势[16]，未来临床中症状温和、乃至无临床症状感染的非洲猪瘟病例可能出现，“耐过猪”难以被及时发现，使防控形势更加复杂。因此，快速、准确、便捷的诊断技术是控制和预防非洲猪瘟疫情的重要手段，解析ASFV的特点，研制出安全、有效的疫苗是目前防控形势的迫切要求。