PCR 技术在饲料微生物检测中的应用研究

2022-11-22古丽娜孜海如拉库来汗巴依多拉

中国畜禽种业 2022年3期

古丽娜孜·海如拉库来汗·巴依多拉

（新疆维吾尔自治区兽药饲料监察所 830063）

由饲料源性污染物引发的畜禽胃肠疾病和中毒报道时有发生，饲料品质不仅影响动物正常生长，也关乎畜产品安全和社会公共卫生，对饲料微生物的检测具有重要意义。PCR（Polymerase Chain Reaction,PCR）扩增技术是一种快速检测目的基因或DNA 序列的体外扩增技术。通过变性-退火-延伸等步骤实现目的基因“放大”。由PCR 发展起来的检测方法有多重PCR、逆转录PCR、巢式PCR、荧光定量PCR 等，PCR扩增产物可以定量和定性分析检测结果，且耗时短，对检测人员技术要求不高，除了广泛应用于饲料微生物检测外，还在食品、生物和医药多个领域进行应用。

1 饲料中病原微生物的检测

1.1 应用于大肠杆菌的检测

饲料作为畜牧业产业化发展的原料供应品，若饲料原料及其制品受到污染，不仅导致畜禽腹泻及大规模疫病流行，还会危害人畜禽产品质量和人类安全。大肠杆菌种类较多，不同类型导致的临床症状和毒性特征也有所差异。多重PCR 是一种可应用于多样本、高通量的检测技术，在常规PCR 检测基础上，通过一个PCR 反应体系扩增多对引物，且检测结果准确、快速。

李金磊等对463 批饲料及其原料进行多重PCR 扩增检测，结果发现，阳性检出率为2.6%，12 批样本污染主要集中在肠致病性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌。其中肠致病性大肠杆菌7 批，阳性率为1.5%，产肠毒素大肠杆菌3 批，阳性率为0.65%，肠出血性大肠杆菌2 批，阳性率为0.43%[1]，表明多重PCR 检测技术可以应用于饲料中大肠杆菌的主动监测，降低食源性病原微生物对人畜的危害。陈玲对威胁公共卫生安全的肠出血性大肠杆菌O157:H7 进行检查，以双重PCR 扩增饲料样本中肠出血性大肠杆菌O157:H7 片段，研究发现，双重PCR 检测方法的敏感度可达到100cfu，若扩增前进行4h 的增菌处理，检测限可下降至20cfu，和传统的细菌性检测方法相比，PCR 检测省时省力，符合饲料现场检测需求[2]。闵文光等设计了大肠埃希菌O157 eae A 基因和志贺菌、副溶血性弧菌的特异性引物，利用多重PCR 检测方法同时扩增3 种食源性致病菌，结果发现，若混合8 种不同致病菌，这3 种食源性致病菌特异性较强，且操作快速、特异性较高，可广泛应用于食源性致病菌的快速检测[3]。

1.2 应用于黄曲霉毒素的检测

黄曲霉毒素属于真菌毒素，其强烈的致毒作用可使食用的人畜癌症和畸形。我国长江以南地区污染凸出，玉米、花生污染严重，当饲料含水量超过20%且温度在35℃以上时容易滋生致病菌。多重PCR、逆转录PCR（RT-PCR）和巢式PCR均可检测饲料中黄曲霉毒含量，与传统的细菌分离培养检测相比，PCR 检测技术的灵敏性和特异性高。

任显凤通过平板计数法、RT-PCR 和高效液相色谱法对粮油中黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮含量进行检测，结果发现，RT-PCR 检测结果与其他2 种方法检测结果相符，2 个毒素的检出限分别为0.02ng/ml 和8×102孢子/g，RT-PCR 检测可以实现粮油中小分子污染物和食源性致病菌的同步检测，和平板计数法和高效液相色谱法相比具有较强的检测优势[4]。秦文彦等通过多重PCR 对可污染饲料和食品进行检测，结果发现，扩增后获得的PCR 片段和基因库比较，同源性高达99%，该方法优化后可用于6 种曲霉和1 种青霉基因检测，对DNA 浓度要求较低，每微升样本含有1ng 样本即可进行特异性检测[5]。刘裴清等利用巢式PCR 扩散7 种黄曲霉菌，结果发现，巢式PCR 可使检测灵敏度达10fg，该方法还能检测人工接种和自然发病的玉米及花生样本[6]。

1.3 应用于沙门氏菌的检测

沙门氏菌是日常生活常见的病原菌之一，宿主广泛，人和畜禽感染后会出现腹泻、胃肠炎或急性败血症状。杨美荣和马超越通过荧光定量PCR 对饲料中的沙门氏菌进行检测，结果发现，与国标检测方法（细菌培养和生化反应实验）相比，空白饲料、人工或自然污染的饲料中沙门氏菌检测结果与国标方法相符，但从检测特异性看，荧光定量PCR 检测方法更具有优势，且检测耗时短，表明荧光定量PCR 适应于批量饲料沙门氏菌的检测[7]。舒畅等利用常规培养法、PCR 法、EMAPCR 法、Romer 快速检测法4 种不同方法检测饲料及其原料中的沙门氏菌，结果发现，不同检测方法的阳性样本检出结果不同，Romer 快速检测法检测出的阳性沙门氏菌样本（6 份）最少，常规培养法和EMA-PCR 法均检出7 份，而PCR 法检出9 份，且容易出现假阳性结果，EMA-PCR 是将DNA 结合染料叠氮溴乙啶和常规PCR 检测方法相结合的检测技术，能降低假阳性率，和常规检测方法的吻合率高达100%，因此，是一种优于传统PCR 检测技术的快速检测饲料沙门氏菌的方法[8]。刘艳环等设计了鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和其他肠道病原菌引物，对动物源性饲料进行PCR 扩增，结果发现，PCR 检测动物源性饲料沙门氏菌具有特异性强、检测时间快的优点，检测敏感性为10～100cfu/50L，是一种饲料沙门氏菌的快速检测方法[9]。

2 功能微生物的检测

2.1 乳酸菌

功能微生物是畜禽养殖中常用的一种微生态制剂，不仅具有杀菌特性，还能促进畜禽肠道菌群平衡，可作为新型绿色饲料添加广泛应用在畜禽日粮中。张娜娜等通过荧光定量PCR检测嗜酸乳酸杆菌，检测灵敏度高达3pg，实验重复性较好，相对偏差低于2.6%，表明荧光定量PCR 在食品和饲料乳酸菌的检测中具有快速、准确的优点[10]。

2.2 地衣芽孢杆菌

畜禽日粮中添加适量的地衣芽孢杆菌可以促进动物消化酶的分泌，有利于日粮中不易消化的纤维素、木质素的降解，提高饲料消化利用率。宋帆等利用实时荧光PCR 检测饲料添加剂中是否含有地衣芽孢杆菌，结果发现，实时荧光PCR 检测技术的特异性高，检测灵敏度可达到103cfu/ml[11]。于新友等在NCBI 中针对地衣芽孢杆菌促旋酶B 亚单位基因色剂特异性，通过PCR 方法成功构建了地衣芽孢杆菌的检测技术，扩增结果的假阳性率低，是一种特异性和灵敏度较高的检测方法[12]。