不同外源物质对高温胁迫下平邑甜茶幼苗的缓解效应

何晓龙，刘怀特，尚雨薇，张纪冉，徐继忠，梁博文

（河北农业大学 园艺学院，河北 保定 071001）

苹果是世界四大果树之一，也是我国栽培面积最大的果树。良好的生态环境是果树赖以生存的条件和基础，对果树生长发育具有极其重要的影响。20 世纪以来，由于“温室效应”的影响，全球温度上升了1.5 ～5.8 ℃［1］。高温胁迫作为植物在生存环境中的主要非生物胁迫因子，即使短暂的高温胁迫也会引起植物形态、生化和生理的变化，对许多植物产生伤害，从而极大的影响植物体生长和发育的过程［2-3］。因此缓解高温对苹果的伤害是亟待解决的问题。

近年来，大量学者研究发现水杨酸（Salicylic acid, SA）、 褪 黑 素（Melatonin, MT）、 多 巴 胺（Dopamine, DA）等外源物质在提高植物抗逆性方面效果显著，但针对苹果植株耐热性方面的研究还较少。SA 是植物体内普遍存在的一种酚类化合物，是一种能够激活植物过敏反应和系统获得抗性的重要内源信号分子；在诱导植物抗热性、抗病性、抗寒性、抗盐性等抗性中发挥着重要的作用［4］。MT，化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺，是一种高度保守的吲哚类化合物［5］。大量研究表明，MT 具有较强的抗自由基作用，能够清除植物体内·OH、H2O2、NO 等活性氧自由基［6］，延缓叶绿素降解［7］，调节抗坏血酸和谷胱甘肽等抗氧化剂水平［8］，缓解非逆境胁迫对植物生长发育的不利影响。DA 是儿茶酚胺的一种，与植物抗逆有重要的关系，许多研究结果表明DA 能够提高植物对胁迫的适应能力，保护植物在逆境条件下正常生长发育。如外源DA 能够调节盐胁迫下平邑甜茶的光和能力、离子平衡及SOS 信号，并能够通过调控抗氧化酶活性及抗氧化剂水平来缓解盐胁迫对平邑甜茶造成的伤害［9］。此外，外源施加DA 能够提高平邑甜茶的光合速率和叶绿素含量，增强参与氮代谢的酶活性，提高苹果植株对低氮胁迫的耐受性［10-11］。

虽然目前针对上述3 种物质参与植物响应逆境胁迫的研究较多，但针对苹果植株响应高温胁迫的研究鲜有报道。本试验以苹果生产中的常用砧木平邑甜茶为试材，通过叶面喷施不同外源物质并结合人工模拟高温环境的处理方法，探讨其对高温胁迫下平邑甜茶幼苗相关生理特性及关键基因表达变化的影响，以期为苹果植株响应高温胁迫提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

本试验于2021 年7 月在河北农业大学创新试验园进行，供试材料为2 年生平邑甜茶实生苗，采用为2 ∶1 ∶1（体积比）的泥炭土、珍珠岩和蛭石混合基质进行培养，置于温室进行统一常规管理，之后选取75 株长势一致、生长健壮的平邑甜茶幼苗采用叶面喷施的方式进行处理。平邑甜茶幼苗被平均分为5 组，每天上午8:00—10:00 对其中3 组幼苗叶片正反面分别均匀喷施外源物质，以叶片全部湿润为宜，其余2 组喷施等量去离子水作为对照，连续喷施7 d 后将平邑甜茶幼苗转入光照培养箱[光照强度为400 μmol/ (m2·s)，光/暗周期为12 h/12 h]进行高温处理，24 h 后进行取样测定。

本试验设置5 个处理，每个处理15 株幼苗：（1）常温对照CK：常温环境（25 ℃/17 ℃，昼/夜，12 h/12 h），叶片喷施去离子水；（2）高温对照ST：高温环境（42 ℃/40 ℃，昼/夜，12 h/12 h），叶面喷施去离子水；（3）SA 处理：高温环境（42 ℃/40 ℃，昼/夜，12 h/12 h），叶面喷施100 μmol/L的外源水杨酸；（4）MT 处理：高温环境（42 ℃/40 ℃，昼/夜，12 h/12 h），叶面喷施100 μmol/L 的外源褪黑素；（5）DA 处理：高温环境（42 ℃/40 ℃，昼/夜，12 h/12 h），叶面喷施100 μmol/L 的外源多巴胺。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 叶绿素含量和叶绿素荧光参数的测定 参照Arnon［12］方法测定各处理叶片叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量；采用Mini - Iamage -PAM 调制叶绿素荧光成像系统（德国，WALZ 公司）测定叶绿素荧光参数［13］。

1.2.2 叶片相对电导率、MDA 含量、超氧阴离子产生速率以及H2O2含量的测定 相对电导率根据Dionisio-Sese［14］的方法采用雷磁 DDS-307 电导率仪测定；MDA 含量采用硫代巴比妥酸法测定［15］；超氧阴离子产生速率采用羟胺氧化法测定［16］；H2O2含量使用相应检测试剂盒（苏州科铭生物）按照说明书的方法测定。

1.2.3 可溶性蛋白、可溶性糖和淀粉含量的测定 可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝染色法测定［17］；可溶性糖和淀粉含量采用蒽酮比色法测定［15］。

1.2.4 抗氧化酶含量的测定 超氧化物歧化酶（SOD）采用氮蓝四哚光还原法测定［18］；过氧化物酶（POD）采用愈创木酚法测定［19］；过氧化氢酶（CAT）采用紫外吸收法测定［15］；抗坏血酸过氧化物酶（APX）、谷胱甘肽还原酶（GR）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）和单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）采用相对应的检测试剂盒（苏州科铭生物）按照说明书的方法测定。

1.2.5 基因定量表达分析 根据制造商的说明，使用M5 Plant RNeasy Complex Mini Kit（多糖多酚植物样本RNA 提取试剂盒）提取叶片总RNA。使用用于第1 链cDNA 合成系统的UEIrisIIRTPCR 系统进行反转录。通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）LightCycle 96 实时PCR 系统测定MhSOD、MhPOD、MhcAPX等抗氧化酶相关基因，MhHSP17.3、MhHSP90-5、MhHSP70等热休克蛋白基因以及MhATG3a、MhATG5-1、MhATG18α等自噬相关基因的表达水平，以β-actin作为内标。每个样本设立3 个独立的生物重复。引物序列如表1。

表1 实时定量引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.3 数据处理与分析

数据采用SPSS26.0 软件进行统计学分析，采用 Tukey’s 检验进行多重比较（P＜0.05），Sigma Plot 14.0 软件作图。

2 结果与分析

2.1 外源物质预处理对高温胁迫下平邑甜茶叶片表型的影响

如图1 所示，常温对照CK 的苹果幼苗叶片鲜绿，无热害症状。高温胁迫处理24 h 后，所有植株的叶片都受到不同程度的伤害，高温对照ST 叶片受害症状最重，叶面呈卷曲变褐，出现大面积水渍状烫伤斑点；而经外源物质处理的植株叶片萎蔫程度较轻，其中以喷施水杨酸的叶片受害症状最轻。

图1 高温胁迫处理24 h 后平邑甜茶叶片表型Fig. 1 Leaf phenotype ofMalus hupehensisleaves after 24 hours of high temperature stress treatment

2.2 外源物质预处理对高温胁迫下平邑甜茶叶绿素含量及叶绿素荧光的影响

如图2 所示，高温胁迫24 h 后，高温对照ST的叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素含量最低，分别比CK 降低了48.06%、56.54%和51.08%，且差异显著（P＜0.05）。而施加SA、MT 和DA 处理叶片总叶绿素含量均维持较高水平，与ST 叶片相比，分别升高了38.14%、24.31%和26.40%。高温胁迫显著降低了平邑甜茶叶片的Fv/Fm，其中以高温对照ST 的幼苗叶片Fv/Fm值最低，较CK 下降了39.38%，而外源物质处理明显提高了高温胁迫下Fv/Fm，SA、MT和DA 处理分别比高温对照ST 明显提高26.27%、23.12% 和7.62%（图2D）。SA、MT 和DA 处 理均能维持高温胁迫下苹果叶片叶绿素和Fv/Fm在较高水平，并且以SA 处理效果最好。

图2 不同外源物质对高温胁迫24 h 后平邑甜茶叶绿素a（A）、叶绿素b（B）、总叶绿素（C）和Fv/Fm（D）的影响Fig. 2 Effects of different exogenous substances on chlorophyll a (A), chlorophyll b (B), total chlorophyll (C) andFv/Fm(D)ofMalus hupehensisplants under high temperature stress for 24 hours

2.3 外源物质预处理对高温胁迫下平邑甜茶叶片膜脂过氧化程度的影响。

如图3A 所示，高温胁迫后，平邑甜茶幼苗叶片相对电导率显著升高，其中以高温对照ST 处理的相对电导率值最大，较CK 相比升高了157.6%，而SA、MT 和DA 处理显著降低了叶片相对电导率，分别较ST 处理下降了43.5%、29.7% 和27.4%。从图3B 上可以看出，高温胁迫显著升高了叶片中MDA 含量的积累，但施加外源物质均能显著降低MDA 含量的积累，分别较ST 处理降低了22.17%、10.17% 和16.8%。由图3C 和3D 可知，高温胁迫下平邑甜茶幼苗叶片内ROS 大量积累，过氧化氢含量和超氧阴离子产生速率的变化相一致，较ST 相比，3 种外源物质处理均显著降低了叶片中ROS 的含量，其中SA 处理的幼苗叶片的超氧阴离子产生速率和过氧化氢含量最低，为13.53 μmol/(g·min)和28.76 μmol /g，分别是高温对照ST 的0.64和 0.78 倍。

图3 不同外源物质对高温胁迫处理24 h 后平邑甜茶相对电导率（A）、MDA 含量（B）、超氧阴离子产生速率（C）和过氧化氢含量（D）的影响Fig. 3 Effects of different exogenous substances on the relative electrolyte leakage (REL, A), malondialdehyde (MDA, B),production rate of superoxide anion (C) and H2O2concentration (D) ofMalus hupehensisplants under high temperature stress treatment for 24 hours

2.4 外源物质预处理对高温胁迫下平邑甜茶叶片可溶性糖、淀粉及可溶性蛋白含量的影响

如图4 所示，与CK 相比，高温胁迫显著升高了平邑甜茶叶片可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白含量，而喷施外源SA、MT 和DA 均显著提高了高温胁迫下平邑甜茶叶片上述物质的含量。高温处理24 h 后，叶片中可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白含量均是SA处理最高，分别是ST 处理的1.15、1.59 和1.49 倍。

图4 不同外源物质对高温胁迫处理24 h 后平邑甜茶可溶性糖（A）、淀粉（B）和可溶性蛋白（C）含量的影响Fig. 4 Effects of different exogenous substances on the contents of soluble sugar (A)，starch (B)and soluble protein (C) ofMalus hupehensisplants under high temperature stress treatment for 24 hours

2.5 外源物质预处理对高温胁迫下平邑甜茶抗氧化酶活性的影响

与CK 植株相比，高温胁迫处理后，除GR 酶外，不同预处理植株叶片中APX 酶、MDHAR 酶、DHAR 酶、SOD 酶、POD 酶和CAT 酶活性均呈不同程度的升高（图5）。此外，SA、MT 和DA 预处理下的叶片抗氧化酶活性相对于ST 处理来说均显著升高，外源SA、MT 和DA 预处理的幼苗叶片APX 酶、GR 酶、MDHAR 酶、DHAR 酶、SOD 酶、POD 酶和CAT 酶活性分别升高了43.14%、31.37%和23.53%，57.50%、30.00%和25.00%，100.0%、36.36% 和27.27%，95.28%、60.38% 和43.40%，34.51%、27.52% 和13.23%，26.51%、15.67% 和14.46%，68.84%、44.93% 和39.13%。 其 中， 以SA 处理的酶活性最高。

图5 不同外源物质对高温胁迫处理24 h 后平邑甜茶抗氧化酶活性的影响Fig. 5 Effects of different exogenous substances on antioxidant enzymes activities ofMalus hupehensisplants under high temperature stress treatment for 24 hours

2.6 外源物质预处理对高温胁迫下平邑甜茶抗氧化相关基因表达的影响

为了进一步检测外源物质预处理对抗氧化酶活性的影响，对其合成途径相关基因进行了定量分析（图6）。高温胁迫下，与CK 相比，ST 处理显著上调了MhSOD、MhPOD、MhCAT、MhMDHAR、MhDHAR1、MhDHAR2、MhcAPX、MhcAPX基因的表达，同时外源物质预处理的植株中其表达量均显著高于ST 处理，且以SA 处理表达量最高。以MhCAT为例，SA、MT、DA 处理的表达量分别为ST 处理的2.74、1.95 和2.13 倍（图6C），结果表明外源物质预处理提高了抗氧化酶相关基因的表达，有利于提高植株相关抗氧化酶活性。

图6 不同外源物质对高温胁迫处理24 h 后平邑甜茶抗氧化相关基因表达的影响Fig. 6 Effects of different exogenous substances on the expression of antioxidant- related genes inMalus hupehensisplants under high temperature stress for 24 hours

2.7 外源物质预处理对高温胁迫下平邑甜茶热休克蛋白相关基因表达的影响

对不同处理植株叶片的6 个热应激响应基因（MhHSP17.3、MhHSP101、MhHSP90-5、MhHSP90-6、MhHSP70、MhHSP70-2） 进 行 了 表达分析，结果表明高温胁迫显著上调了这6 个基因的表达（图7），其中MhHSP17.3上调倍数最大，为CK 处理的1 000 多倍。此外，外源物质预处理的植株叶片热激响应基因上调幅度均显著高于ST 处理植 株。以MhHSP90-5和MhHSP70-2为 例，SA、MT、DA 3 种处理的表达量分别是ST 处理的2.27、2.16、1.51 倍（图7C）和2.67、1.88、1.16 倍（图7F）。

图7 不同外源物质对高温胁迫处理24 h 后平邑甜茶热休克蛋白相关基因表达的影响Fig. 7 Effects of different exogenous substances on the expression of heat shock protein-related genes inMalus hupehensisplants under high temperature stress for 24 hours

2.8 外源物质预处理对高温胁迫下平邑甜茶自噬相关基因表达的影响

高温胁迫下叶片中自噬相关基因MhATG3a、MhATG3b、MhATG7a、MhATG5-1、MhATG5、MhATG10、MhATG8c、MhATG8i、MhATG18α的表达均有所变化，与常温对照（CK）相比，高温胁迫下所有处理植株叶片自噬相关基因表达量均显著上调（图8）。此外，外源物质预处理的叶片中基因表达量均显著高于清水对照预处理（ST）的植株，结果表明高温胁迫下这3 种外源物质预处理能够上调植株叶片中自噬相关基因的表达量。其中以SA 处理上调幅度最大，MhATG3a、MhATG3b、MhATG7a、MhATG5-1、MhATG5、MhATG10、MhATG8c、MhATG8i、MhATG18α等表达量分别是ST 处理的1.99、3.58、1.62、2.02、1.98、1.79、1.15、2.22、2.36 倍（图8）。

图8 不同外源物质对高温胁迫处理24 h 后平邑甜茶自噬相关基因表达的影响Fig. 8 Effects of different exogenous substances on the expression of autophagy-related genes inMalus hupehensisplants under high temperature stress for 24 hours

3 讨论与结论

叶绿素是植物进行光合作用的物质基础，环境因子的改变会使植物体内叶绿素的合成速率降低，加速叶绿素降解，进而导致植株的光合性能改变［20-21］。本试验结果表明，高温胁迫下平邑甜茶植株叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素含量均显著下降，这可能是由于高温胁迫抑制了参与叶绿素生物合成的酶或加速了叶绿素的降解［22-23］；但是喷施外源物质的各处理叶绿素含量均显著高于ST，其中喷施外源水杨酸的处理叶绿素含量最高，说明喷施适宜浓度的外源物质能够减缓高温胁迫下苹果植株叶片中叶绿素的降解，这与Wassie［24］在紫花苜蓿植株上得出的结论一致。高温胁迫还会对植株叶片光系统Ⅱ造成伤害，Wu 等［25］发现在热胁迫条件下三叶期玉米幼苗叶片中的最大光化学量子产量（Fv/Fm）较对照组显著降低，Fv/Fm的降低说明热胁迫降低了光能向光系统Ⅱ反应中心传递的效率，这导致电子传递量子效率降低，光合作用受到抑制。本试验中，高温胁迫下添加外源水杨酸、褪黑素和多巴胺后叶绿素含量和Fv/Fm值均显著升高，说明施加外源物质能够有效缓解高温胁迫对苹果叶片叶绿素的破坏作用，提高叶绿素含量，促进并保护其光合系统，缓解了高温对植株叶片造成的伤害。

大量研究表明高温胁迫会使植物体电解质外泄，细胞膜通透性改变，活性氧（ROS）大量积累，引起膜脂过氧化，MDA 含量升高，最终导致细胞膜发生损伤［26-27］。本试验中，高温胁迫下苹果叶片的相对电导率和MDA 含量较对照组显著升高，ROS大量积累，而喷施3 种外源物质均显著降低了相对电导率和MDA 含量，减缓ROS 的积累，这说明喷施适宜浓度的外源物质能够有效地清除植株体内多余的ROS，保护细胞膜的完整性，缓解了高温逆境对植物造成的危害。外源物质在植物体最主要功能就是作为第一道防线来抵御环境变化而造成的氧化胁迫［5,28］。其主要表现就是通过清除活性氧自由基和上调抗氧化酶基因来行使这一功能。活性氧的清除主要包括酶促防御系统和非酶促防御系统［29］。酶促防御系统主要包括SOD、POD、CAT 以及抗坏血酸-谷胱甘肽循环中的一些抗氧化酶构成，可溶性蛋白、淀粉等物质为非酶促防御系统中的主要成分，它们在清除活性氧自由基的过程中起着重要作用，一方面可以直接与活性氧反应，将其还原：另一方面通过提高有机或无机物质来提高细胞液浓度，降低渗透势，减轻活性氧对植物造成的伤害［30］。在本研究中发现外源物质预处理均能够显著上调抗氧化酶相关基因，提高了SOD、APX、GR 等抗氧化酶的活性，此外喷施外源物质还提高了可溶性蛋白、淀粉等物质的含量。说明喷施外源物质能够提高植株叶片可溶性蛋白等物质含量，降低细胞渗透势，提高抗氧化酶的活性，能够更有效地清除高温胁迫下植物体内产生的活性氧，进而减少活性氧的积累，最终提高苹果植株对高温胁迫的耐受性。

热休克蛋白（Hsps）是高温胁迫诱导的主要功能蛋白，基于蛋白分子大小，热休克蛋白共分为7类：分别为Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90、Hsp00、Hsp110 以及小分子热休克蛋白（sHsps）［31］。大量研究表明热休克蛋白能够调节热胁迫下植物细胞内蛋白质的折叠和积累，阻止细胞内变性蛋白的积累，保护植物细胞免受胁迫伤害，还能够促进胁迫后受损细胞的恢复［32］。霍柳青［33］的研究发现高温胁迫会诱导热激蛋白Hsp 的表达，Hsp 能够使在高温胁迫下变性的蛋白复性，从而减轻植物细胞在高温下的损伤。在本研究中我们通过对5 个处理的6 个热休克蛋白响应基因检测，高温处理显著上调了这些基因的表达，其中以外源激素预处理的植株叶片上调幅度更大。热休克蛋白基因的上调表达，在一定程度上增强了植株抵抗高温胁迫的能力。

自噬是真核细胞中一种进化高度保守的、用于降解老化受损或细胞器并重复循环利用降解产物的过程，与植物体的多种生理和病理过程密切相关［34］。因此推测高温胁迫下，喷施外源物质后自噬相关基因的表达量的提高可能会增强植株的自噬活性，增强清除膜上受损细胞和蛋白的效率，从而缓解植株在高温环境下所受到的伤害。此外有证据还表明自噬能够通过清除植株体内受损的叶绿体来保护植物细胞，还增强了抗氧化酶的活性，减缓活性氧的积累，维持其在高温逆境环境下的活性［33］。但是不同自噬基因在逆境环境下具体发挥哪些功能仍需进一步的探究。

综上，高温胁迫下外源喷施水杨酸、褪黑素和多巴胺等外源物质均能够维持平邑甜茶植株较高叶绿素水平；同时能够通过提高抗氧化相关酶活性和可溶性蛋白等物质含量降低植株体内活性氧和丙二醛等的积累，维持膜稳定性；此外，还通过上调抗氧化酶相关基因、热胁迫蛋白相关基因和自噬相关基因的表达等提高苹果植株对高温胁迫的耐受性。