硫酸-甲醇衍生化对烟草中乙酰丙酸质量分数测定的影响

刘瑞红，谢复炜，王晓瑜，潘立宁*，余晶晶，刘克建，陈满堂，孙学辉，黄龙

1.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001 2.湖北中烟工业有限责任公司，武汉市东西湖金山大道1355号 430048

乙酰丙酸又称γ-戊酮酸，是烟叶酸味特征组分中酸味的主要来源之一［1］。研究表明，乙酰丙酸具有甜香、焦甜香，能够协调烟气、增加烟气丰满度，是烟叶风格、质量研究的重要指标［2-5］，也是美国以及我国烟草制品许可使用的添加剂，因此，准确测定烟草中乙酰丙酸的含量（质量分数，用α表示）对了解烟叶内在质量、改进叶组配方和加香加料等具有重要指导意义。因烟草中的有机酸大部分以碱金属盐或有机碱盐的形式存在，只有小部分以游离形式存在，所以检测时一般先进行衍生化处理，再使用GC法进行分离分析［6-10］。硫酸-甲醇甲酯化-GC法由于具有原料易得、方法简单可控、结果准确度高等优点，已成为检测烟草中包括乙酰丙酸在内的难挥发酸和高级脂肪酸的最常用分析方法之一。如张霞等［11］采用硫酸-甲醇甲酯化-固相萃取富集-气相色谱法测定了烟草中乙酰丙酸等9种有机酸；郭明全等［12］利用硫酸-甲醇甲酯化-GC-FID法考察了部位、品种、海拔高度对四川烟区烟叶中乙酰丙酸等有机酸的影响；景延秋等［13］利用硫酸-甲醇甲酯化-GC-MS法检测了烤烟不同叶位叶片中乙酰丙酸等有机酸的含量。然而，相关研究表明，生物质中的糖类物质经酸催化水解可产生乙酰丙酸［14-16］。烟草作为一种天然生物质，含糖量较高，采用硫酸-甲醇对烟草中乙酰丙酸进行衍生化处理时，糖类物质可能会随之水解，进而对乙酰丙酸质量分数（用α乙酰丙酸表示）的测定产生影响。目前测定烟草中α乙酰丙酸均未考虑硫酸-甲醇衍生化时糖类水解的影响。基于此，本研究中对硫酸-甲醇甲酯化检测烟草中α乙酰丙酸的过程进行探索，分析了甲酯化时间和温度等对检测结果的影响；探究了烟草中5种常见糖类化合物对α乙酰丙酸的贡献；比较了烟草实际样品中果糖质量分数（α果糖）和蔗糖质量分数（α蔗糖）与α乙酰丙酸的关系，旨在为烟草中乙酰丙酸质量分数的准确测定提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

263个烟叶样品（2019年从全国八大香型烟叶产区的80个取样点采集的X2F、C3F、B3F 3种等级烟叶）。

乙酰丙酸（97%），己二酸（99%），十六酸（97%）（日本东京化成工业株式会社）；丁二酸（99%），苹果酸（99%）（美国ThermoFisher公司）；D-（-）-果糖（99%），D-（+）-葡萄糖（99%），D-（+）-蔗糖（99%），肌醇（99%）（北京百灵威科技有限公司）；甲醇（色谱纯，99.9%），二氯甲烷（色谱纯，99%），D-（+）-麦芽糖（99%）（德国Merck集团）；蒸馏水（香港屈臣氏集团）；十二水合磷酸氢二钠（AR，99%），无水硫酸钠（AR，99%），浓硫酸（AR，95%～98%）（上海国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（HPLC级，99.9%）（北京迪马科技有限公司）；氨水（HPLC级，99.9%）（德国CNW公司）。

CP2245电子天平（感量0.000 1 g，德国Sartorius公司）；HH-ZK4恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）；EYELA MMV-1000 W分液漏斗振荡器（日本东京理化器械株式会社）；HY-8机械振荡仪（常州国华电器有限公司）；6890N气相色谱仪（配氢离子火焰检测器），6890N气相色谱-5977B质谱联用仪，1200系列高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；ELSD2000ES蒸发光散射检测器（美国Alltech公司）；有机相滤膜，水相滤膜（0.22μm，上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

（1）衍生化试剂。衍生化试剂为5%（体积分数）硫酸-甲醇溶液，配制时采用量筒准确量取3 800 mL甲醇至5 000 mL烧杯中，量取200 mL浓硫酸，边搅拌边加入，冷却至室温后，转移至棕色瓶中，常温密封放置。

（2）Na2HPO4-NaCl混合水溶液。分别称取90 g Na2HPO4·12H2O和40 g NaCl，加入1 000 mL水，采用630 W的功率超声，边超声边搅拌，至完全溶解。

（3）有机酸标准工作液。内标溶液：称取1.00 g己二酸至150 mL烧杯中，加入约40 mL甲醇超声至完全溶解，放置至室温后转移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容。系列浓度标准工作溶液：称取1.00 g乙酰丙酸（其他有机酸标准溶液称量：丁二酸0.02 g、苹果酸1.00 g、十六酸0.10 g）至150 mL烧杯中，加入约40 mL甲醇超声至完全溶解，放置至室温后转移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到乙酰丙酸储备液；分别移取上述储备液125µL、250µL、500µL、1 mL、2 mL、5 mL于不同的50 mL容量瓶中，用硫酸-甲醇溶液定容，摇匀，然后转移至100 mL平底烧瓶中，加入300μL内标溶液和50 mL硫酸-甲醇溶液，将烧瓶与冷凝管紧密连接，在80℃水浴中回流120 min，冷却至室温，得到甲酯化溶液。取5 mL甲酯化溶液至125 mL分液漏斗中，依次加入10 mL Na2HPO4-NaCl混合水溶液和7.5 mL二氯甲烷，于分液漏斗振荡器上以220 r/min的转速振荡10 min。振荡结束后，取下分液漏斗，静置10 min，然后取下层二氯甲烷溶液至盛有4.00 g Na2SO4的50 mL锥形瓶中；向分液漏斗中继续加入7.5 mL二氯甲烷，重复萃取，合并两次萃取液。摇动锥形瓶，使萃取液与Na2SO4充分接触，然后机械振荡30 min，振荡频率为180 r/min。将萃取液过有机相滤膜，得到系列浓度有机酸标准工作溶液。

（4）糖混合标准工作溶液。称取约0.12 g果糖、0.12 g葡萄糖、0.08 g肌醇、0.08 g蔗糖、0.08 g麦芽糖，精确至0.1 mg，置于150 mL烧杯中，加入约50 mL水至完全溶解后，转移至100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度线得到糖类储备液。依次移取上述储备液0.312 5、0.625 0、1.250、2.500、5.000 mL于不同的10 mL容量瓶中，用水定容，摇匀，得到系列浓度糖混合标准工作溶液。

1.2.2 样品前处理及分析

（1）硫酸-甲醇衍生化。称取1.00 g烟末样品（或100 mg糖标准品）至100 mL平底烧瓶中，然后同1.2.1节（3）中加入300μL内标和50 mL硫酸-甲醇溶液，于80℃水浴中回流120 min，冷却至室温后即得到甲酯化溶液。

（2）提取。同1.2.1节（3）中步骤：取5 mL上述甲酯化溶液至125 mL分液漏斗中，依次加入10 mL Na2HPO4-NaCl混合水溶液和7.5 mL二氯甲烷，以220 r/min的转速振荡10 min后，静置10 min，然后将二氯甲烷溶液转移至盛有4.00 g Na2SO4的50 mL锥形瓶中；重复萃取后，合并两次萃取液。萃取液与Na2SO4充分接触后，再以180 r/min的频率机械振荡30 min。将萃取液过有机相滤膜后，采用GC-FID法分析。

（3）糖含量测定。称取0.10 g烟末样品，置于100 mL锥形瓶中，准确加入50 mL水，超声萃取30 min，取2 mL超声后溶液，经水相滤膜过滤后，采用高效液相色谱-蒸发光散射法测定。

1.2.3 仪器条件

（1）GC-FID法。色谱柱：DB-5MS（60 m×0.25 mm×0.25µm）石英毛细管柱；进样量：1μL；分流比：5∶1；进样口温度：280℃；载气：氦气；载气流速：1.5 mL/min；程序升温：40℃（3 min）280℃（30 min）。FID检测器温度：280℃；氢气流速：40 mL/min；空气流速：400 mL/min；尾吹气：氦气，流速30 mL/min。所用气体纯度均为99.999%。

（2）GC-MS法。气相色谱条件同GC-FID法。离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；质量扫描范围：29～450 amu；采用NIST17质谱库进行色谱峰定性。所用气体纯度均为99.999%。该方法主要用于定性烟草样品和糖在保留时间13.3 min处的甲酯化产物种类。

（3）高效液相色谱-蒸发光散射法。色谱柱：Prevail Carbohydrate ES色谱柱（5µm，250 mm×4.6 mm）；洗脱条件：等度洗脱；流动相：向1 L 72%（体积分数）乙腈水溶液中加入4 mL氨水，预混合；流速：0.8 mL/min；柱温：20℃；进样量：10μL；检测时间：20 min；检测器：蒸发光散射仪；氮气流速：2.2 L/min，纯度99.999%；漂移管温度：100℃；增益：1。

2 结果与讨论

2.1 定性分析

已知GC-MS和GC-FID均可用于有机酸甲酯化产物的测定，二者各有优缺点。GC-MS选择性强，可通过MS的特定碎片离子扫描区分没有被气相色谱柱完全分离的物质，而GC-FID的测量重复性远远优于GC-MS［17］。国家计量检定规程（JJG 700—2016［18］）要 求GC-FID法的定量重复性的RSD≤3%，而国家计量技术规范（JJF 1164—2006［19］）对GC-MS法测量重复性要求仅为RSD≤10%。因此，针对需长期测定大量样品及对测定结果的重复性要求较高的情况，在满足待测物质分离度的条件下，优先选择GC-FID法进行检测。本研究中基于大批量、长时间测定有机酸的情况，采用GC-FID法对烟草样品（2.1～2.3节所用烟叶样品为X2F、C3F、B3F 3种等级烟叶均匀混制）经硫酸-甲醇甲酯化后的二氯甲烷萃取液进行分析，结果如图1所示，发现保留时间13.3 min处存在一个面积较大的色谱峰。

图1 烟草样品甲酯化产物的GC-FID色谱图Fig.1 GC-FID chromatogram of methyl esterification product of tobacco sample

基于GC-MS法进一步分析烟叶样品甲酯化后的萃取液，保留时间13.3 min处对应物质的质谱结果如图2a所示。通过检索NIST17谱库及与乙酰丙酸标准品的甲酯化产物质谱图（图2b）比对，确认了此化合物为乙酰丙酸甲酯。

图2 保留时间13.3 min处烟叶样品甲酯化产物和乙酰丙酸甲酯的质谱图Fig.2 Mass spectra of methyl esterification product of tobacco sample and methyl levulinate at retention time of 13.3 min

为进一步确认该化合物，分别测定了0.02 g乙酰丙酸、1.00 g烟叶样品和（0.02 g乙酰丙酸+1.00 g烟叶样品）三者对应的硫酸-甲醇甲酯化产物在保留时间13.3 min处的GC-FID色谱图，如图3所示。对保留时间13.3 min处的色谱峰进行积分，结果见表1，发现向1.00 g烟叶样品中加入0.02 g乙酰丙酸后，其甲酯化产物在13.3 min处的色谱峰面积明显增大，且其峰面积大小约为0.02 g乙酰丙酸甲酯化产物和1.00 g烟叶样品甲酯化产物在此处的色谱峰峰面积之和，进一步验证了此化合物为乙酰丙酸甲酯。

图3 加标实验中甲酯化产物在保留时间13.3 min处的GC-FID色谱图Fig.3 GC-FID chromatogram of methyl esterification product at retention time of 13.3 min in spiked experiment

表1 加标实验中甲酯化产物在保留时间13.3 min处的GC-FID色谱峰面积Tab.1 GC-FID chromatographic peak areas of methyl esterification product at retention time of 13.3 min in spiked experiment

2.2 硫酸-甲醇衍生化条件对烟草中乙酰丙酸质量分数测定的影响

如图4a和图4b所示，为了分析硫酸-甲醇衍生化条件对烟草中乙酰丙酸质量分数测定的影响，分别测定了衍生化时间为120 min时，不同衍生化温度（60、70、80℃）条件下以及衍生化温度为80℃时，不同衍生化时间（60、75、90、105、120 min）条件下烟草样品中有机酸甲酯化产物的响应。结果表明，衍生化时间从60 min延长到120 min时，乙酰丙酸甲酯的响应增加约1倍；衍生化温度由60℃升至80℃时，乙酰丙酸甲酯响应增加约2倍，而烟草样品中丁二酸、苹果酸、十六酸等其他有机酸的甲酯化产物的响应在上述衍生化时间和温度范围内变化不大。说明乙酰丙酸的衍生化过程和烟草中其他有机酸相比差异较大。

图4 不同衍生化时间和温度下烟草样品中有机酸甲酯化产物的归一化响应Fig.4 Normalized response of methyl esterification product of organic acids in tobacco samples at different derivatization time and temperatures

此外，在上述时间和温度条件下对乙酰丙酸标准品进行甲酯化衍生，结果如图5所示。可见，乙酰丙酸标准品的甲酯化产物响应受衍生化时间和温度影响不大。说明烟草中乙酰丙酸衍生化的异常现象和烟草样品基质有关，初步猜测可能是由烟草中糖类水解导致的。

图5 不同衍生化时间和温度下乙酰丙酸标准品甲酯化产物的归一化响应Fig.5 Normalized response of methyl esterification product of levulinic acid standard sample at different derivatization time and temperatures

2.3 硫酸-甲醇衍生化条件下糖的水解

为了验证上述猜测，分别称取果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和肌醇等5种糖标准品各0.10 g至不同的100 mL平底烧瓶中进行硫酸-甲醇衍生化处理，基于GC-FID法分析硫酸-甲醇甲酯化衍生后的二氯甲烷萃取液，结果见图6。可见，果糖和蔗糖的甲酯化产物在保留时间13.3 min处均存在较大的色谱峰，而葡萄糖、麦芽糖和肌醇在此处没有色谱峰产生。基于GC-MS法分析甲酯化后的果糖和蔗糖样品萃取液，保留时间13.3 min处的质谱结果如图7所示，与图2比较发现果糖和蔗糖在硫酸-甲醇衍生化条件下均水解产生了乙酰丙酸甲酯。

图6 5种糖类样品甲酯化产物的GC-FID谱图Fig.6 GC-FID spectra of methyl esterification products of five sugars

图7 2种糖类在保留时间13.3 min处的甲酯化产物质谱图Fig.7 Mass spectra of methyl esterification products of two sugars at retention time of 13.3 min

此外，采用GC-FID法对不同衍生化时间和温度下果糖和蔗糖（均为0.10 g）的硫酸-甲醇甲酯化产物分别进行分析，结果如图8所示，发现果糖和蔗糖在保留时间13.3 min处的甲酯化产物响应随衍生化时间和温度的变化趋势与烟草样品中乙酰丙酸甲酯的变化趋势（图4）相同。进一步说明采用硫酸-甲醇甲酯化法测定烟草中的乙酰丙酸质量分数时出现的异常现象与果糖和蔗糖有关。

图8 不同衍生化时间和温度下果糖和蔗糖二者对应的甲酯化产物的归一化响应Fig.8 Normalized responses of methyl esterification product corresponding to fructose and sucrose at different derivatization time and temperatures

分析上述不同衍生化条件下果糖和蔗糖产生的乙酰丙酸甲酯的GC-FID色谱峰，结果见表2，发现同一衍生化条件下，果糖产生的乙酰丙酸甲酯的峰面积约为相同质量蔗糖产生的乙酰丙酸甲酯峰面积的2倍。说明相同衍生化条件下，相同质量蔗糖转化生成的α乙酰丙酸约为果糖的1/2，原因可能是在硫酸-甲醇衍生化条件下，蔗糖首先水解生成一分子果糖和一分子葡萄糖，而葡萄糖在甲酯化条件下不产生乙酰丙酸，仅果糖能生成乙酰丙酸。

表2 不同衍生化条件下果糖和蔗糖产生的乙酰丙酸甲酯的色谱峰面积Tab.2 Chromatographic peak areas of methyl levulinate produced from fructose and sucrose under different derivatization conditions

2.4 基于实际样品分析验证

为了进一步验证上述结论，采用高效液相色谱-蒸发光散射法测定了263个烟草样品中的α果糖和α蔗糖，并采用硫酸-甲醇衍生化-GC法测定相应烟草样品中的α乙酰丙酸，比较了相同样品中2种糖的质量分数和α乙酰丙酸的关系。烟草样品中α果糖远大于α蔗糖，因此，先分析α果糖和α乙酰丙酸的关系，结果如图9a所示。可见，利用硫酸-甲醇衍生化法测得的α乙酰丙酸与α果糖呈正相关，说明烟草中的果糖对α乙酰丙酸测定结果存在显著影响。2.3节中的实验结果表明，蔗糖水解生成的果糖对α乙酰丙酸也有贡献，因此，将烟草中原有的果糖质量分数及蔗糖水解得到的果糖的质量分数（用α蔗糖/2表示）加和后，分析其与α乙酰丙酸的关系，结果如图9b所示。图9a和9b的线性拟合方程和相关系数见表3，可知，考虑蔗糖水解得到的果糖成分后线性关系变好，其相关系数大于0.900 0，进一步验证了利用硫酸-甲醇衍生化法测得的α乙酰丙酸受烟草中果糖和蔗糖水解生成的果糖的影响，导致测定结果不能反映烟草中乙酰丙酸的真实值。若要准确测定烟草中乙酰丙酸的质量分数，可采用无需高温或酸性前处理条件的高效液相色谱法或离子色谱法［20-22］。

图9 烟草实际样品中α乙酰丙酸与α果糖、α果糖+α蔗糖/2的关系Fig.9 Relationships of levulinic acid with fructose mass fractions，the mass fraction sum of fructose and fructose obtained by sucrose hydrolysis in tobacco samples

表3 烟草实际样品中α乙酰丙酸与α果糖、α果糖+α蔗糖/2的线性方程和相关系数Tab.3 Linear equations and correlation coefficients between levulinic acid and fructose mass fractions,the mass fraction sum of fructose and fructose obtained by sucrose hydrolysis in tobacco sample

3 结论

①硫酸-甲醇衍生化时间和温度对甲酯化后烟草样品中乙酰丙酸甲酯响应的影响不同于其他有机酸甲酯；②在硫酸-甲醇衍生化条件下，对烟草中常见的5种糖类成分进行处理，分析其二氯甲烷萃取液发现果糖和蔗糖在甲酯化条件下能产生乙酰丙酸甲酯，其中，相同质量的果糖产生的乙酰丙酸甲酯约是蔗糖产生量的2倍，而葡萄糖、麦芽糖、肌醇在衍生化过程中不产生乙酰丙酸甲酯；③通过比较263个实际烟草样品中的果糖和蔗糖质量分数与硫酸-甲醇衍生化法测定得到的烟草中乙酰丙酸质量分数的关系，证明硫酸-甲醇衍生化法测定烟草中的乙酰丙酸受烟草中果糖和蔗糖的影响。