水产胶原的制备工艺及自组装性能研究进展

张军涛，汪海波＊，徐丽明

（1.武汉轻工大学 化学与环境工程学院，湖北武汉430023；2.中国食品药品检定研究院，北京102629）

引言

典型的I型胶原（以下称胶原）是一类具有长而坚韧的三螺旋结构的纤维状、大分子蛋白质，由2条α1肽链和1条α2肽链相互缠绕形成，每条肽链均含有(Gly-X-Y)n重复氨基酸序列[1]。胶原因来源的广泛性和良好的生物学性能而在组织工程和生物医学材料等领域得到广泛应用[2]。然而，随着胶原应用领域的不断拓展以及部分国家和地区的宗教文化限制，传统的哺乳动物胶原已不能完全满足应用需求，特别是近年来人畜共患疾病（如口蹄疫和疯牛病等）的频繁爆发，更使得哺乳动物胶原制品的生物安全性受到质疑[3]。因此，寻找新兴胶原资源作为传统哺乳动物胶原的替代品或补充品成为该领域的迫切需求。

中国是世界渔业大国，水产养殖业的蓬勃发展同步带动水产加工业的壮大。水产加工过程中，有效利用部分只占其总体重的约25%，剩余的近75%被称为废弃物[4]。其中，30%部分（主要为鱼皮、鱼鳞、鱼骨等）富含胶原成分，成为胶原制取的重要来源之一。特别值得注意的是，水产动物因在品种、栖息环境、习性等方面差异较大而具有比哺乳动物胶原更多样化的结构和性能特征，从而为胶原产品的制备和应用创造了更大的选择空间。近年来，国内外诸多学者围绕水产胶原的制取方法、理化性质及其在生物医学领域的应用开展了大量研究并取得一系列成果。已有部分综述性文章针对水产天然活性胶原及其变性产物的制备和应用等进行回顾性分析[5]。本文着重针对近十年来水产动物源天然活性胶原（不包含明胶和肽等胶原变性产物）的制备方法、不同鱼种和组织的胶原得率和自组装性能研究进行系统性回顾和综述，以期为关注该领域的研究人员提供参考。

1 水产胶原的提取纯化

与哺乳动物胶原提取过程类似，水产胶原的提取过程一般包括选材、除杂、提取和纯化等步骤，其关键在于最大限度的提高胶原得率、保障胶原纯度以及分子结构和生物功能的完整性。水产胶原的提取操作一般在低温条件（低于15℃）下进行，以免受热变性。

1.1 预处理

鱼皮、鱼鳞和鱼骨等原料中往往含有大量的非胶原类蛋白和一定量的脂质、多糖等成分，而鱼鳞和鱼骨中还含有大量的无机成分。因此，为了降低胶原提取纯化过程的难度，需要对原料进行预处理，一方面尽可能的脱除非胶原成分，另一方面使原料中胶原组织结构松散而利于胶原提取。

1.1.1 杂蛋白和脂质的脱除

脱除杂蛋白一般采用碱性或盐溶液，如氢氧化钠、碳酸氢钠、氯化钠等，其中最常用的是氢氧化钠。Liu等[6]以草鱼皮为原料，研究了脱杂蛋白过程中氢氧化钠浓度对所得胶原的影响，结果表明，高浓度氢氧化钠会导致胶原纤维的不均匀溶胀，从而影响后续脱脂、提取过程。因此，宜用弱碱进行脱杂蛋白操作[7]。

脱脂一般采用可溶解脂质的有机溶剂，如醇和醚等。除最常用的叔丁醇外，其它醇类和非离子型脱脂剂也见诸报道，如Xu等[7]以南方鲶鱼皮为原料，依次采用15%的异丙醇和非离子型脱脂剂处理，最优脱脂率达90.24%。

传统脱杂蛋白和脂质操作往往会产生大量碱液和有机废液，从而污染环境。为了克服这一问题，有学者采用发酵法进行胶原提取的预处理操作。芽孢杆菌（Bacillus Velezensis FEL-BM21）是从冻土中分离得到的一种可以在低温条件下分解脂肪和蛋白质的细菌。Song等[8]以罗非鱼皮为原料，比较了芽孢杆菌发酵法和传统方法进行预处理对胶原提取得率的影响。结果表明，发酵法所得酸溶性胶原（Acid-soluble collagen，ASC）和酶溶性胶原（Pepsin-soluble collagen，PSC）的产率略高于化学法。

1.1.2 色素的脱除

胶原一般为白色冻干海绵或粉末状固体，而鱼皮含有的色素会影响其外观颜色。因此，为了获得良好表观质量的胶原，一般采用双氧水或活性炭对鱼皮原料进行脱色。其中，双氧水可以破坏鱼皮黑色素的发色基团而达到产品脱色的目的，效果优于活性炭的物理吸附作用，因此，双氧水是目前水产胶原脱色最常用的方法。Xu等[7]采用0.5%双氧水处理南方鲶鱼皮原料，改善了所得胶原的表观性能。Liu等[9]采用双氧水处理乌鳢鱼皮脱色素的研究表明，胶原的提取得率及颜色和结构完整性与双氧水的浓度和pH关系密切。

1.1.3 无机成分的脱除

鱼鳞和鱼骨中含有的大量羟基磷灰石成分，因与组织中的胶原成分紧密结合而增大胶原提取难度。因此，对于该类原料还需要进行脱钙处理。常用的脱钙试剂为乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA），也有学者尝试用酸处理替代。Liu等[10]分别采用EDTA和盐酸对罗非鱼骨进行脱钙处理，结果表明盐酸的脱钙速度较快，但会导致胶原得率变低，且会影响胶原三螺旋结构的完整性。

1.2 酸法提取胶原

游离态胶原易溶于酸，因此，一般采用酸性溶液提取胶原成分。值得注意的是，胶原在动物组织中存在游离态和纤维态两种形式，而后者的比例会随动物生长时间而逐渐提高。通常情况下，成年哺乳动物组织中游离胶原的含量较低，因此采用单一的酸法提取胶原的得率往往较低；而水产动物代谢较快，生长周期短，其体内游离态胶原含量远高于哺乳动物，直接采用酸法提取即可获得较高的得率[11]。

在酸法提取过程中，适量的酸会改变胶原分子表面的电荷密度，进而影响胶原分子间的静电相互作用，并破坏分子间的氢键、席夫碱等相互作用，从而使得天然活性胶原溶于酸液中。酸法提取得到的胶原具有完整的三螺旋结构，且分子末端含有非螺旋的端肽结构，被称为酸溶性胶原（ASC）。一般采用乙酸、甲酸、乳酸、盐酸、柠檬酸、酒石酸等提取胶原，其中以乙酸最为常用。Skierka[12]以波罗的海鳕鱼皮和杂交鲟鱼皮为原料，比较了0.5 mol/L柠檬酸、乳酸、乙酸以及盐酸对胶原提取效果的影响。结果表明，乙酸和乳酸的提取效果最好，盐酸最差。

在酸法提取过程中，除了酸的种类具有重要影响外，酸的浓度、提取温度和时间以及固液比、鱼皮破碎程度等也会影响胶原得率。Menezes等[13]以罗非鱼皮为原料，采用乙酸（固液比1/25）取ASC的研究表明，低酸浓度、高提取温度和长提取时间有利于提高胶原得率。Sadowska等[14]采用乙酸从波罗的海鳕鱼皮中提取ASC，研究表明在乙酸提取胶原的过程中固液比越低、鱼皮破碎程度越高，提取效果越好。

除了传统的无机酸和有机酸以外，超临界流体技术等也被用于提取胶原。如Sousa等[15]采用二氧化碳增压获得的碳酸化水从大西洋鳕鱼皮中提取胶原，以13.8%的得率得到ASC。

1.3 酸/酶法提取胶原

由于酸法无法提取交联纤维状态的胶原组分，因此，往往采用酶水解结合酸溶出的策略提高胶原得率。部分酶可以特异性切断纤维状态胶原分子两端非螺旋区域（端肽）的共价键交联而不影响其三螺旋结构，从而使得胶原转变为游离态并溶出[16]。此外，去除端肽还能有效降低胶原的免疫排斥缺陷，有利于其在组织工程领域的应用。酸/酶法提取得到的胶原具有完整的三螺旋且不含端肽结构，一般被称为酶溶性胶原（PSC），常用的酶包括猪胃蛋白酶、水产源胃蛋白酶、植物源和真菌源酶等，其中以猪胃蛋白酶的应用最广泛。Benjakul等[17]以两种大眼鲷鱼皮为原料，比较了金枪鱼和猪胃蛋白酶对胶原提取的影响。结果表明，金枪鱼胃蛋白酶的提取效率更高。Mizuta等[18]以真菌（Rhizopus niveus）酸性酶代替传统的猪胃蛋白酶从菱鳍乌贼皮中提取胶原的研究表明，两种酶具有类似的活性，胶原的得率无明显差异。Nurilmala等[19]采用木瓜蛋白酶从黄鳍金枪鱼皮中提取PSC，结果表明酶浓度越高，所得PSC的得率也越高。值得注意的是，酶的活性与温度关系密切，在酶的最适温度下进行胶原提取可以获得较高的得率，但也可能导致胶原受热变性。Aukkanit等[20]以银线鲈鱼皮为原料，研究了温度对乙酸/胃蛋白酶法提取胶原得率和结构的影响。结果表明，10℃条件下胶原的得率最高；当温度升至20℃和28℃时，则对胶原的结构和性能产生不利影响。

1.4 利用辅助手段提高胶原得率

超声、匀质等辅助技术可以提高胶原的得率。Kim等[21]在乙酸提取海鲈鱼皮胶原的过程中采用超声辅助法提高了胶原的得率，而且能降低提取时间和酸的用量，但过度超声会破坏胶原结构。Zou等[22]以甲鱼鳖裙为原料提取胶原的过程中使用超声辅助法，得率比传统方法提高了16.3%，且不会影响胶原的三螺旋结构。而Karnjanapratum等[23]采用超声辅助酸法提取七星刀鱼皮胶原的研究表明，过度超声虽然可以提高胶原得率，但是也会导致胶原降解而降低纯度。Tan等[24]以斑点叉尾鮰鱼皮为原料，研究了匀质辅助对胶原提取的影响，结果表明，匀质辅助可以将胶原得率由传统法的42.36%提升到60.38%。与传统的胶原纯化方法相比，超滤、电渗析等技术可以提高胶原的纯化效率。Chen等[25]采用酸/酶法提取红鼓鱼鳞胶原的过程中采用基于聚醚砜膜的亲水超滤法分离纯化产品，其效率远高于传统的透析法。Chen等[26]在酸法提取东方鲀鱼皮胶原的过程中采用电渗析法代替传统的透析法纯化胶原，不仅可以提高胶原的得率，而且能减少纯化时间和产生的废水。

1.5 原料对胶原提取效果的影响

水产动物种类繁多，可作为胶原提取原料的种类也十分丰富，不同来源的水产原料，其胶原提取得率、结构、性能等均存在不同程度的差异（不同来源鱼类和不同组织部位提取胶原的得率差异如表1所示）。即使同种类鱼，由于栖息环境、生长时间以及不同提取组织部位等也会对胶原提取得率产生影响。Lee等[27]选用海水和淡水虹鳟鱼为样本，采用0.5 mol/L乙酸（固液比1/10）提取3 d分别以61.6%±0.2%和60.9%±0.1%的得率得到ASC，进一步研究表明，养殖环境（海水或淡水）对鱼皮中胶原组成和性能无明显影响。Pan等[28]以深海和浅海生长的圆眼燕鱼皮为原料，采用0.5 mol/L乙酸和胃蛋白酶（0.1 mg/mL）提取24 h分别以52.38%和33.96%的得率得到PSC。对于同种鱼的不同组织而言，其鱼皮、鱼鳍、鱼鳞、鱼骨中胶原含量依次降低[30]；为了获得较高的胶原产率，可以依次采用酸法和酸/酶法对原料进行提取。如采用酸法提取鱼皮原料中的ASC，产率在58.62%~4.7%之间；针对所得残渣进一步采用酸/酶法再次提取，仍可以26.5%~6.5%的产率获得PSC。

表1 不同来源鱼类和不同组织部位提取胶原的得率差异Tab.1 The extracted yield of collagen from different fish and different tissues

2 水产胶原的自组装性能调控

2.1 水产胶原自组装监测方法

在适宜的外界条件下，天然胶原通过分子间相互作用（氢键、静电、疏水相互作用），可以自发有序聚集形成纤维状产物，这一过程称为自组装，是胶原固有的分子行为特征（图1）。所得胶原纤维的机械性能、热变性温度和耐酶降解性能等均优于胶原单分子，因此，自组装被广泛应用于提高胶原基生物医学材料的性能。

图1 胶原自组装及纤维产物示意图。（a）胶原单分子；（b）胶原微纤维；（c）胶原纤维及其SEM图（d）和TEM图（e）Fig.1 Schematic of the self-assembly of collagen and the resulting fibrils

水产胶原自组装的监测方法主要有浊度法、流变学方法、荧光法和电镜法等。自组装过程中，胶原因聚集形成大尺度的纤维和网络结构而导致体系透光率的变化。因此，通过紫外-可见分光光度计监测体系透光率（浊度）的变化可以便捷表征胶原的自组装行为。典型的胶原自组装过程由成核期、快速增长期和平衡期三部分构成，其浊度曲线呈“S”型。在成核期，胶原分子聚集成核，是自组装的关键步骤，浊度值无明显变化；在快速增长期，胶原开始自组装形成纤维和纤维网络，浊度值快速升高；在平衡期，胶原的自组装基本完成，浊度值不再变化。由于胶原自组装形成的纤维网络结构使得溶液体系转化为凝胶体系，体系的粘性模量和弹性模量均会发生变化。因此，胶原自组装过程还可以采用流变学方法进行监测。该方法不仅可以揭示胶原自组装的动力学过程，还可以表征所得凝胶产物的机械性能。

除了传统的浊度法和流变学方法以外，某些特定荧光性物质，如芘、硫黄素T，因与胶原或胶原纤维的特异性结合而被用于胶原的自组装行为监测[38-39]。

2.2 水产胶原自组装调控

温度是胶原自组装的关键因素。水产胶原自组装的最适温度往往低于哺乳动物胶原，如牛跟腱胶原一般在35~37℃条件下进行自组装，而水产胶原的最适组装温度一般低于30℃[40]。除温度外，胶原自组装还受外环境因素的影响。Zhang等[41]采用流变学方法研究了胶原浓度、温度、pH、离子强度等外环境因素，对其自组装行为及所得凝胶产物机械性能的协同影响机制。

除常规环境影响因素外，外加分子和外力场以及端肽结构、三螺旋结构完整程度等也会对胶原自组装产生影响。Zhang等[16]运用浊度和流变学方法开展了端肽对乌鳢皮胶原自组装行为的影响研究，结果表明端肽的存在不仅可以提高胶原自组装速率，而且可以提高所得凝胶产物的机械性能。Zhai等[42]研究了离子液体对草鱼皮胶原自组装行为的影响。离子液体会抑制胶原的自组装行为，但可以提高所得产物的热变性温度和机械性能。Nan等[43]研究了超高压对牛蛙皮胶原结构和性能的影响。结果表明，超高压处理会使得胶原自组装速率变慢，所得纤维产物的直径增加。

受不同类型胶原杂化纤维的启发，有学者在体外实现异源胶原共组装，以期获得良好性能的胶原基材料。如Wei等[44]将牛蛙皮胶原与猪皮胶原共混，分别采用浊度实验和荧光淬灭实验证实了异种胶原之间的共组装行为。所得杂化纤维的直径和D周期均小于单一胶原纤维产物；所得凝胶产物的机械性能也与单一胶原凝胶不同，但是共组装并不会影响产物的生物相容性。

3 总结和展望

水产胶原具有良好的生物安全性和功能性等特点，而且原料丰富，来源广泛，具有多样性的结构和性能，因此，水产胶原有望成为极具前途的绿色可再生生物医学材料。与此同时，水产加工废弃物为具有高性价比的胶原提供了丰富的来源，从水产加工废弃物中提取胶原不仅提高水产加工行业的附加值，而且能降低对环境污染的压力。然而，也必须认识到水产胶原及其提取应用过程中的不足和缺陷：（1）水产动物种类繁多，不同鱼种及组织中胶原含量及类型不同，需要进行进一步深入研究，以便为胶原原料的选择提供指导；（2）水产胶原的制备工艺尚需进一步优化，特别是针对色素、腥味等的去除方法以及大规模工业化制备工艺，如酸碱溶液的使用和排放等，进行深入探究，在保持胶原结构和性能的前提下，尽可能提高胶原的得率和品质；（3）水产胶原结构和自组装性能之间的构效关系，以及与哺乳动物胶原相比的性能优势和不足仍需深入阐释，以便为水产胶原的大规模临床应用奠定基础。因此，围绕水产胶原仍需开展大量工作，如开发简便、高效的活性胶原提取新工艺，有效降低活性胶原的提取成本，避免提取过程中产生的强酸和强碱等的使用及排放问题；深入挖掘水产胶原的功能特性，进一步拓宽水产胶原的应用领域等。