乙酰肝素酶抑制剂OGT2115通过Wnt/β⁃catenin信号通路促进胆囊癌细胞的凋亡

陈佳伟 常卫才 刘子祥 王郑林 周少波

1蚌埠医学院第二附属医院普外科（安徽蚌埠 233000）；2安徽省组织移植重点实验室（安徽蚌埠 233000）

胆囊癌（gallbladder carcinoma，GBC）在胆道肿瘤中常见，总生存率不到5%［1-2］，其发病隐匿，早期局限性胆囊癌患者通常无症状［3］，放化疗效果差，预后差［4］，大多数患者确诊后都处于疾病晚期，往往无法治愈［3，5-7］，它约占世界范围内所有癌症死亡率的1.7%［8］，到目前为止，关于胆囊癌发病机制和进展的分子改变的研究相对于其他肿瘤癌症较少。乙酰肝素酶是一种通过硫酸乙酰肝素（HS）的酶促切割和非酶促信号传导调节细胞外环境来促进肿瘤进展的蛋白质［9］，可以重塑细胞外基质［10］，调节细胞的一些关键生物过程如增殖、分化以及迁移和侵袭能力等［11-13］。有不少研究发现肝素酶抑制剂在治疗肿瘤方面都具有一定的积极作用，如在骨髓瘤、乳腺癌、口腔舌癌、结肠癌等肿瘤中［14-17］。Wnt/β⁃catenin信号通路在肿瘤中起到重要作用，多项研究表明β⁃catenin在胆囊癌中表达升高［18-19］，且Wnt/β⁃catenin信号通路促进了胆囊癌细胞的进展［20-21］。关于肝素酶抑制剂对胆囊癌和Wnt/β⁃catenin信号通路的调控作用尚未明确，因此本研究旨在评估肝素酶抑制剂OGT2115对胆囊癌的抗肿瘤活性及对初步的相关分子机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料胆囊癌细胞GBC⁃SD购自武汉普诺赛。胎牛血清购自Clark Bioscience；Bax、Bcl⁃2、上皮钙黏素（E⁃cadherin）、β⁃肌动蛋白（β⁃actin）多抗和辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗购自abclonal；Caspase⁃3、β联蛋白（β⁃catenin）、c⁃MYC、细胞周期素D1（Cyclin D1）购自Affinity生物公司；BCA蛋白浓度定量试剂盒购自康为世纪；肝素酶抑制剂OGT2115、Wnt/β⁃catenin信号通路抑制剂IWR⁃1购自MCE；Annexin⁃FITC/PI试剂盒购自联科生物；HPSE、Fas以及β⁃catenin ELISA试剂盒购自泉州睿信生物；CCK⁃8、Hoechst 33342/PI双染试剂盒购自Biosharp；Trizol、反转录试剂以及PCR引物购自上海生工。本研究经蚌埠医学院第二附属医院伦理委员会审核批准（伦理编号：伦动科批字［2021］第309号）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养GBC⁃SD细胞用含10%胎牛血清，1%双抗的RMPI⁃1640完全培养液，细胞培养箱条件为37℃、100%湿度、5%CO2浓度，等细胞培养到贴壁80%～90%左右时，用胰蛋白酶将贴壁细胞消化脱落，1 000 r/min离心5 min；去掉上清后，用新鲜培养液重新吹打成均匀的细胞悬浮液进行传代或者种板。

1.2.2 CCK⁃8检测细胞增殖取在生长对数期的细胞，按每孔2 000个细胞/100 μL接种至96孔板中，观察细胞贴壁后，弃去原培养液，加入新鲜含不同浓度OGT2115的培养液，药物终浓度为0、1、2、4、8 μmo/L，每组设置6个复孔，培养24 h，弃培养液，每孔加入100 μL新的完全培养液和10 μL CCK⁃8试剂，37℃避光孵育2 h后，用酶标仪测定在450 nm波长处的吸光度（OD值），利用公式根据OD值计算药物抑制率，Graphpadprism 9对测得的数据进行非线性回归，测得OGT2115作用于GBC⁃SD的半抑制浓度（IC50）。实验重复3次，取平均值。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡非线性回归测得的IC50为4.579 μmol/L，采用4.0 μmol/L的OGT 2115处理GBC⁃SD细胞，以正常不加药物培养的GBC⁃SD细胞作为对照组。培养箱中培养24 h后，收集106个细胞（包含培养上清中的细胞），4℃预冷的PBS缓冲液洗涤2次，加入bindingbuffer重悬，依次加入AnnexinⅤ⁃FITC 5 μL和PI 10 μL，室温避光孵育10 min，用流式细胞仪上机检测凋亡。

1.2.4 ELISA检测HPSE活性、凋亡及信号通路相关蛋白活性将正常GBC⁃SD与加了OGT2115的细胞培养上清液收集，根据试剂盒的说明进行加样操作，检测HPSE、CD95以及β⁃catenin活性，实验重复3次。

1.2.5 qRT⁃PCR检测凋亡及Wnt/β⁃catenin信号通路相关分子表达将GBC⁃SD用Wnt/β⁃catenin信号通路抑制剂IWR⁃1预处理后，用OGT2115处理，并与正常细胞组和OGT2115组对比，用Trizol提取细胞总RNA，逆转录成cDNA后加样，根据试剂提供的说明书两步法反应条件，用SYBR Green法进行实时荧光定量PCR，反应条件：95℃变性40 s，60℃退火延伸30 s，总计40个循环。引物序列见表1。

表1 qRT⁃PCR引物序列Tab.1 qRT⁃PCR primer sequence

1.2.6 Western blot检测凋亡及Wnt/β⁃catenin信号通路相关蛋白将细胞按上述分组进行药物处理后，用细胞裂解液提取细胞总蛋白，并检测及调整蛋白浓度。取30 μg蛋白进行蛋白凝胶电泳分离，将电泳好的蛋白从凝胶中转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，用1∶1 000稀释的caspase⁃3、Bax、BCL⁃2、β⁃catenin、c⁃myc、Cyclin D1、E⁃cadherin以及β⁃actin抗体在4℃下孵育过夜。将孵好抗体的PVDF膜用TBST洗3遍后，用1∶5 000稀释的山羊抗兔或山羊抗小鼠的IgG二抗在室温孵育2 h，经ECL显色后，在化学发光成像检测仪中曝光成像。

1.2.7 统计学方法用Graphpadprism 9进行相关统计学分析，所有数据以（）表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK⁃8实验结果0、1、2、4、8 μmo/L的OGT2115作用24 h对GBC⁃SD的增殖具有抑制作用，且随浓度的增加抑制率升高。测得OGT2115作用于GBC⁃SD的IC50为4.58 μmol/L。见图1。

图1 不同浓度OGT2115对GBC⁃SD细胞增殖的影响Fig.1 Effect of different concentrations of OGT2115 on the proliferation of GBC⁃SD cells

2.2 Annexin⁃FITC/PI流式检测结果与空白对照相比，OGT2115作用24 h后，GBC⁃SD的凋亡率升高，见图2。

图2 GBC⁃SD Annexin⁃FITC/PI流式细胞图Fig.2 GBC⁃SD Annexin⁃FITC/PI flow cytometry

2.3 ELISA检测结果与对照组相比，OGT2115处理后，细胞上清中HPSE、β⁃catenin活性下降，凋亡相关蛋白Fas升高，见图3。

2.4 凋亡及信号通路相关分子表达结果从qRT⁃PCR和Western blot实验结果看，与对照组相比，OGT2115组和IWR⁃1+OGT2115组的凋亡相关基因caspase⁃3、Bax蛋白表达含量升高，凋亡保护蛋白Bcl⁃2表达含量下降，β⁃catenin、c⁃myc、Cyclin D1、E⁃cadherin表达含量下降，且使用IWR⁃1通路抑制剂预处理后，OGT2115对凋亡及信号通路相关蛋白的作用更为明显，见图4、5。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

图4 各分组不同分子mRNA表达情况Fig.4 Expression of different molecular mRNA in each subgroup

图5 各分组不同蛋白表达情况Fig.5 Expression of different proteins by subgroups

3 讨论

乙酰肝素酶在多种类型的恶性肿瘤中表达升高，与癌症的侵袭性和预后不良相关［17，22-23］。过表达乙酰肝素酶可以促进肿瘤细胞的增殖与生长［24］，而抑制其活性可以降低癌细胞的浸润与迁移［25］，乙酰肝素酶抑制剂作为抗癌治疗剂，也在不断的进行临床试验评估。本研究结果表明，OGT2115，作为一种乙酰肝素酶抑制剂，对胆囊癌细胞的生长抑制具有浓度依赖性。

细胞凋亡是属于一种程序性细胞死亡，在维持生物体的正常生长中起着重要作用［26］。细胞凋亡包括死亡受体介导的外源通路、线粒体介导的内源通路以及内质网通路［27］。在凋亡刺激后，促凋亡蛋白Bax易位至线粒体，细胞色素c则从线粒体释放到细胞质，随后细胞色素c与凋亡蛋白酶激活因子1和pro⁃caspase⁃9结合形成凋亡体的蛋白质复合物，激活caspase⁃3，最终导致细胞凋亡［28］，而Bcl⁃2可以通过维持线粒体膜的完整性和阻止细胞色素c的释放来抑制细胞凋亡［29］。Fas是肿瘤坏死受体家族的成员和死亡受体的原型，可通过激活蛋白酶级联引起配体诱导的细胞凋亡［30］。有研究报道，乙酰肝素酶抑制剂诱导淋巴瘤、膀胱癌等细胞的凋亡［22-30］，在本研究中，ELISA、qRT⁃PCR和Western blot分析结果显示OGT2115下调Bcl⁃2的蛋白表达，提高Bax、Caspase3的蛋白表达水平，促进Fas的表达，进一步证实了OGT2115诱导GBC⁃SD细胞凋亡的发生。

Wnt/β⁃catenin信号通路被公认为是肿瘤进展关键通路，影响肿瘤的生长、转移等各方面。β⁃catenin是Wnt/β⁃catenin通路中至关重要的下游效应子，可以与E⁃cadherin形成复合物促进细胞粘附。在肿瘤细胞中，Wnt信号通路被激活后转移β⁃catenin，进而导致c⁃myc与Cyclin D1的激活，从而促进肿瘤发展［31］。研究表明，HPSE促进HSV⁃1复制后的β⁃catenin活化和信号转导，促进了病毒的活性［32］。本研究结果表明，OGT2115可以抑制GBC⁃SD细胞中β⁃catenin、Cyclin D1、c⁃myc、E⁃cad⁃herin的表达，且抑制该信号通路后，OGT2115对信号通路以及凋亡的作用更为明显。

通过本研究表明肝素酶抑制剂OGT2115处理胆囊癌细胞，抑制GBC⁃SD细胞的生长与活性，能通过Wnt/β⁃catenin通路促进GBC⁃SD的凋亡。