福建青枯雷尔氏菌的遗传多样性及其生防放线菌的筛选

郑雪芳，陈燕萍，肖荣凤，陈梅春，陈 峥，刘欣，王阶平，刘 波

（福建省农业科学院农业生物资源研究所, 福州 350003）

青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum（简称青枯菌）可导致多种重要经济作物毁灭性枯萎[1]，在世界范围内，尤其是中国危害极大，严重威胁世界农业经济发展[2]。青枯菌因其侵染性强，寄主范围大，地域分布广，生存能力强，被认为是世界上危害最大植物病原菌之一[3]。由青枯菌引起的茄科作物青枯病在我国南方地区普遍发生，其中以福建、广东、湖南、浙江及广西危害最为严重[4]。随着全球气侯变䁔，世界范围内青枯病发生危害呈现越来越严重的趋势。

青枯菌是一个非常复杂的类群，呈现出高度种下分化的多态性。例如，根据寄主范围差异，可将青枯菌分为5个生理小种[5]；根据青枯菌对3种双糖（麦芽糖、乳糖、纤维二糖）和3种已醇（甘露醇、山梨醇、甜醇）的氧化能力，可将其划分为6个生化型[6,7]。Fegan和Prior[8]根据青枯菌的基因型提出了演化型分类框架，通过特异性多重 PCR将青枯菌划分为 4个主要的演化型，并根据内源葡聚糖酶基因（endoglucanase gene，egl）的序列相似性确定序列变种。Safni等[9]综合生理生化分析、脂肪酸测定、16S rRNA序列、egl基因序列和DNA杂交分析结果，将青枯菌的不同菌株进行了重新分类和命名，包括演化型Ⅰ和Ⅲ的Ralstonia pseudosolanacearum，演化型Ⅱ的Ralstonia solanacearum，演化型Ⅳ的R.syzygiisubsp.celebesensis、R.syzygiisubsp.syzygii和R.syzygiisubsp.indonesiensis。

放线菌是产生天然生物活性物质的重要微生物资源[10]。据报道，微生物来源的生物活性物质中，约70%由放线菌产生，且这些放线菌中的 80%是链霉菌[11]。链霉菌具有促进植株生长（Plant growth promoting,PGP）和/或病害生防作用，在农业研究领域越来越受到重视[12]。一些链霉菌如金色链霉菌Streptomyces aureofaciens、阿维链霉菌Streptomyces avermitilis、潮湿链霉菌Streptomyces humidus、吸水链霉菌Streptomyces hydroscopicus、铅青链霉菌Streptomyces lividans、利迪链霉菌Streptomyces lydicus、橄榄绿链霉菌Streptomyces olivaceoviridis、褶皱链霉菌Streptomyces plicatus、玫瑰黄链霉菌Streptomyces roseoflavus、结痂链霉菌Streptomyces scabies和紫黑链霉菌Streptomyces violaceusniger能产生各种不同的抗菌物质，抗菌活性强，已被用于土传病害的防治[13-15]。

本研究通过对分离自福建省不同地区番茄、茄子和辣椒3种茄科作物的青枯菌菌株，进行菌株的生化型、演化型和序列变种鉴定，评价其遗传多样性；同时针对不同类群的青枯菌，筛选出具有拮抗作用的生防放线菌，为茄科青枯病的防控探寻新的自然资源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试56株青枯菌分离自福建省不同地区和寄主的青枯病植株，供试的14株放线菌均分离自福建漳州番茄根系土壤，由福建省农业科学院农业生物资源所菌种库保存。青枯菌的参比菌株 GMI1000由福州大学生物科学与工程学院馈赠，菌株的详细信息见表1。青枯菌培养所需的培养基为2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC），参照Kelman[16]方法配制（1% 蛋白胨、0.1%水解酪蛋白、0.5%葡萄糖、1.8% 琼脂和0.05% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑）；蔗糖蛋白胨（sugar and peptone, SP）培养基，用蒸馏水将蔗糖20 g、蛋白胨5 g、磷酸氢二钾0.5 g和硫酸镁0.025 g定容至1 L，pH为7.2，121℃灭菌20 min。放线菌培养所需的培养基为高氏1号培养基：用蒸馏水将可溶性淀粉20 g，氯化钠0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，硝酸钾1 g，磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，重铬酸钾0.05 g，定容至1 L，pH为7.2，121℃灭菌20 min。

表1 供试青枯雷尔氏菌菌株信息Table 1 Ralstonia solanacearum strains used in this study

试剂及仪器：2,3,5-氯化三苯基四氮唑，美国Sigma公司；细菌DNA提取试剂盒、2×TaqPCR MasterMix，杭州博日科技有限公司；其它试剂均为国产分析纯。Life Eco PCR仪，杭州博日科技有限公司；Gel Doc-ItTM凝胶成像系统，美国UVP公司；Eppendorf 5418R高速台式冷冻离心机，德国Eppendorf公司；SW-CJ-1F超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；BI-250AG恒温培养箱，施都凯仪器设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 供试菌株的生化型鉴定 基础培养基配方为NH4H2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KC1 0.2 g，蛋白胨1.0 g，1%溴百里酚蓝水溶液6.0 mL，琼脂15 g，蒸馏水定容至1000 mL，调节pH值至7.2，121 ℃灭菌20 min。将3种双糖（麦芽糖、乳糖、纤维二糖），3种己醇（甘露醇、山梨醇和甜醇）用0.22 µm的微孔滤膜过滤灭菌后，分别加入到基础培养基，使其终浓度为1%。24孔板上每孔加入1 mL 6种不同生化型鉴定培养基和25 mL供试青枯菌菌悬液（107cfu/mL），28 ℃培养21 d，根据各鉴定培养基中指示剂颜色变化的情况，分析菌株对3种双糖和3种己醇的利用能力，确定各代表菌株的生化型的分类归属。

1.2.2 供试菌株的演化型鉴定 采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取青枯菌基因组DNA，根据Fegan和Prior[8]的报道合成青枯菌演化型特异性复合PCR引物（表2）。采用复合PCR法对供试菌株进行PCR扩增。PCR 反应体系为（25 μL）：12.5 μL 2×TaqPCR MasterMix，引物Nmult22: RR 4 μL，其他6个引物各1 μL，模板DNA 1 μL和无菌水1.5 μL。PCR反应程序为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火50 s，72 ℃复性90 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物利用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，DNA Marker为DS2000。

1.2.3 供试菌株的序列变种鉴定 利用引物Endo-F/Endo-R[17]对供青枯菌的egl基因进行PCR扩增，引物序列见表2。PCR反应体系为（25 μL）：12.5 μL 2×TaqPCR MasterMix，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL和无菌水10.5 μL。PCR反应程序为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃复性90 s，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳测定为目标单一条带后，送至福州博尚生物技术有限公司进行序列测定。序列经NTI11.5.3软件编辑后，提交GenBank数据库（菌株登入号见表3），并通过NCBI进行同源性比对；从GenBank数据库下载每个变种1～3个代表性菌株的egl基因序列，用CLUSTAL_X软件进行序列多重比较，采用Mega version 6.0软件[18]和邻接法（Neighbor -Joining，NJ）[19]构建系统发育树，确定供试青枯菌在系统发育树中的位置，明确其归属地位。

表2 供试青枯菌演化型特异性多重PCR和egl基因序列变种的PCR鉴定引物Table 2 Primers used for phylotype specific multiplex PCR and egl gene sequevar identification of the tested strains

1.2.4 青枯菌的生防菌筛选 采用琼脂扩散法，以上述鉴定不同类型青枯菌FJAT-91和FJAT-15304为靶标菌，筛选出具拮抗作用的放线菌。将1 mL菌浓度为1×108cfu/mL的FJAT-91和FJAT-15304分别与9 mL约50 ℃的LB培养基混合后，倒入已制备好的LB固体培养基中，制成含病原菌的双层培养基；待培养基凝固后，用灭菌的打孔器在平板上打孔（直径为7 mm）。供试放线菌经高氏1号液体培养基，30 ℃、170 r/min振荡养7 d后，将培养液过0.22 μm滤膜，随后将200 μL滤液加入双层培养基的孔中，孔中加入双蒸水为阴性对照，孔中加入潮霉素（100 mg/mL）为阳性对照，30 ℃培养3 d后，观察并测量抑菌圈直径。试验设3次重复。

1.2.5 生防菌16S rDNA序列分析及系统发育树的构建 按细菌基因组提取试剂盒（购自上海捷瑞生物工程有限公司）操作步骤提取菌株FJAT-31547的基因组DNA，采用16S rRNA通用引物27F（5′-GAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′）和 1492 R（5′-ACGGCTACCTTG TTACGA CTT-3′）[20]进行 PCR 扩增。PCR 反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火60 s，72 ℃复性90 s，重复33个循环；最后72 ℃下延伸10 min。PCR产物纯化和测序由北京华大基因研究中心完成。获得的16S rRNA序列提交到GenBank。供试菌株16S rRNA序列与EzTaxon数据库（hhtp://eztaxon-e.ezbiocloud.net/）的已知序列进行比对[21]，分析系统发育关系，用CLUSTAL_X软件进行序列多重比较，用Mega version 6软件和NJ法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 青枯菌的生化型鉴定

根据对3种糖（乳糖、麦芽糖、纤维二糖）和3种醇（甘露醇、山梨醇、甜醇）的利用情况将供试的56株青枯菌划分为不同的生化型（表3），53株青枯菌能利用3种双糖和3种已醇，鉴定为生化型Ⅲ；菌株FJAT-15304能够利用3种糖，不能利用3种醇，鉴定为生化型Ⅱ；菌株FJAT-49能利用3种醇、乳糖和麦芽糖，不能利用纤维二糖，菌株FJAT-15466能利用3种糖、山梨醇和甜醇，不能利用甘露醇，这表明菌株FJAT-49和FJAT-15466为非标准型生化型。

2.2 青枯菌的演化型鉴定

演化型复合PCR检测结果表明，供试的56株青枯菌均扩增出大小分别为280和144 bp的2条特异性条带（图1），其中280 bp为青枯菌特异扩增条带，144 bp为演化型Ⅰ的特异性扩增条带。表明这56株青枯菌均属于演化型Ⅰ，即亚州分支菌株。

图1 部分供试青枯菌演化型复合PCR扩增结果Fig.1 Phylotype specific multiplex PCR product patterns of partial strains of Ralstonia solanacearum

2.3 青枯菌的egl基因序列变种鉴定

基于egl基因序列对福建不同地区及寄主的56株青枯菌进行序列变种鉴定，采用邻接法构建系统发育树，供试菌株均聚集在亚洲分支，即演化型I分支上（表3，图2）。分离自茄子的青枯菌均属于以PSS358为参比菌株的序列变种15；24株分离自辣椒的青枯菌（除了FJAT-74）均与序列变种14的参比菌株PSS81聚在同一类群；分离自番茄的青枯菌中，序列变种15最多，有9株，其次是序列变种16，共7株，序列变种14有3株，属于序列变种13、17、44和55的青枯菌均为2株；从总体来看序列变种14和15为福建省茄科青枯菌的优势菌系，分别占供试菌株48.21%和23.21%。

表3 福建省青枯菌egl基因序列变种的分布及寄主来源Table 3 Distribution and host sources of egl sequevars in Ralstonia solanacearum strains isolated from Fujian province

续表3

图2 基于egl基因序列构建的青枯菌系统发育进化树Fig.2 A phylogenetic tree of Ralstonia solanacearum based on egl gene sequences

2.4 不同变种青枯菌的生防放线菌筛选

供试的14株放线菌中只有菌株FJAT-31535对生化型Ⅲ、序列变种16的青枯菌FJAT-91具有抑菌活性，抑菌圈直径为13.87 mm，略低于阳性对照的抑菌圈直径（15.54 mm），未筛选到对生化型Ⅱ、序列变种15的青枯菌FJAT-15304有抑菌效果的放线菌（表4）。

表4 不同放线菌对青枯雷尔氏菌的抑菌活性Table 4 Antibacterial activities of the different actinomycete strains against Ralstonia solanacearum

2.5 生防菌FJAT-31535的鉴定

菌株FJAT31535在高氏1号培养基上生长良好，30℃培养7 d，FJAT31535的菌落形态为圆形、灰白色、边缘细丝状突起，表面干燥、有褶皱，贴紧培养基生长，不易挑起（图3A，B）。

图3 菌株FJAT31535在高氏1号平板上（A）和体视镜下（B）的菌落形态特征Fig.3 Colony morphology of the strain FJAT31535 on a Gause’s No.1 plate (A) and under a stereomicroscope (B)

利用细菌16S rRNA通用引物扩增菌株FJAT31535的16S rRNA基因序列，获得序列长度为1396 bp，序列提交GenBank（登录号：ON038371）。FJAT-31535序列与GenBank和Ezbioclound数据库已知序列比对，结果表明，其与弗氏链霉菌模式菌株RSU15T的16S rRNA基因序列相似性最高，为100%。利用MEGA 6.0软件NJ法构建系统发育树（图4），结果表明，FJAT-31535与弗氏链霉菌模式菌株RSU15T聚在一类群（图4）。基于形态、生理生化特性和16S rRNA基因序列相似性，菌株FJAT-31535鉴定为链霉菌属。

图4 基于16S rRNA序列构建菌株FJAT31535系统发育树Fig.4 The phylogenetic tree of the strain FJAT31535 based on 16S rRNA sequences

3 讨论

青枯菌具有丰富的种内遗传多样性[22,23]，其致病性和菌系变化与寄主作物品种、栽培方式及外界环境均存在较大关系[24]。通过生理小种和生化型进行的青枯菌菌系划分存在一定的局限性，不能有效地反映出病原菌在遗传进化及地理起源上的差异[25]。Fegan等[8]在第三届青枯病国际会议上提出青枯菌演化型分类框架，将青枯菌依次划分为种（Species）、演化型（Phylotype）、序列变种（Sequevar）以及克隆（Clone）4个不同水平的分类单元，并建立了与之相对应的鉴定方法。

本研究采用演化型复合PCR检测体系结合传统的生化型鉴定方法对分离自福建8个地区的番茄、辣椒和茄子寄主的 56株青枯菌进行演化型划分和生化型鉴定，结果表明，福建茄科青枯菌大部分属于生化型Ⅲ、演化型Ⅰ，为亚州分支菌株，与前人研究结果相吻合[4]。Xue等[26]、She等[27]研究证实我国青枯菌可分为生化型Ⅲ和Ⅳ，以生化型Ⅲ为主；而生化型Ⅲ和Ⅳ均属于演化型Ⅰ菌株。徐进等[4]对45株福建烟草青枯菌演化型和生化型鉴定结果表明，45株青枯菌均属于演化型Ⅰ，43株属于生化型Ⅲ，说明福建茄科寄主青枯菌中，生化型Ⅲ是占居优势或普遍存在，但这个生化型在南、北美洲和奥洲并不多见[27]。本研究从番茄寄主分离的1株青枯菌FJAT-15304，鉴定为生化型Ⅱ、演化型Ⅰ，一方面说明青枯菌生化型分布的复杂性，另一方面也证明同一省同一寄主上存在不同生化型。青枯菌生化型在地理来源和寄主范围分布的复杂性，可能与种苗带毒和频繁调运有关[28]。

根据演化型分类框架，基于egl基因序列，每个演化型可进一步划分为一系列的序列变种。目前，青枯菌有超过15个序列变种[27,29]。序列变种分类与生理小种、寄主和地理来源相关[30]。潘哲超等[6]、刘海龙等[31]研究福建、贵州、湖北等地烟草青枯菌序列变种时发现，来自相同烟区的序列变种相对单一；He等研究发现，采集同一乡镇或毗邻乡镇的同一寄主的青枯菌，大多具有相同的序列变种[23]。本研究发现，福建茄科青枯菌种以下分类存在亚州分支的7个序列变种。寄主番茄存在的序列变种较多，遗传多样性较为丰富，与前人研究结果一致[32]，表明福建番茄青枯菌的遗传多样性较高，这个研究结果将为抗病品种的选育和青枯病的防控提供理论参考。

Anuratha和 Gnananickam[33]研究表明，青枯菌具有复杂的遗传多样性，在离体条件下生防菌 DZ-9、BS2004和DZ-42对青枯菌生化型Ⅲ均表现出较显著的拮抗效果，但对生化型V却未显示明显的抑制作用。本研究同样发现，生防放线菌FJAT-31535对生化型Ⅲ的青枯菌FJAT-91具有明显的拮抗作用，而对生化型Ⅱ的青枯菌FJAT-15304无拮抗作用，这说明生防菌并非对所有生化型青枯菌都有抑制作用，从而给病害防治带来了一定的难度。此外，放线菌已被广泛用于生防菌剂的开发与利用[34]，它们通常寄居根系土壤，保护植株免受病原真菌或细菌侵染[35]。本研究筛选到一株放线菌 FJAT-31535，对生化型Ⅲ的青枯菌具有明显的拮抗效果，未来可以考虑利用这个菌株防治由生化型Ⅲ的青枯菌引起的茄科青枯病。