植物源甘油酯与金龟子绿僵菌对黄曲条跳甲的室内毒力及田间防效评价

闫建全，刘 豪，陈力嘉，卢慧林，陈逢浩，侯军晓，杨 蓉，欧阳雄发，欧阳革成，孟 翔*

（1.广东省科学院动物研究所/广东省动物保护与资源利用重点实验室/广东省野生动物保护与利用公共实验室，广州 510260；2.华南农业大学植物保护学院，广州 510642；3.广州大学生命科学学院，广州 510006；4.广州骄阳农业公司，广州 510653；5.广州欧联生物科技有限公司，广州 510520）

黄曲条跳甲Phyllotreta striolata(Fabricus)隶属鞘翅目Coleoptera叶甲科Chrysomelidae，是严重为害白菜、萝卜、甘蓝等十字花科蔬菜的重要害虫之一[1]。黄曲条跳甲成虫主要取食植株地上部分，造成叶片孔洞；卵产于茎基部附近土壤，孵化幼虫于土壤中取食细根或根毛，导致根系吸水能力下降，引起植株地上部叶片萎焉枯死，严重影响蔬菜产量和质量[2]。由于田间十字花科蔬菜大面积种植及其常年连作，导致黄曲条跳甲的发生及为害程度逐年加重，造成了严重的经济损失[3,4]。目前，化学农药仍旧是防治黄曲条跳甲的主要手段，但化学农药长期、大量使用，不仅会增加黄曲条跳甲的抗药性，还对生态环境和农产品安全等产生负面影响[5]。因此，寻找黄曲条跳甲的新型绿色安全防治方法至关重要。

植物源甘油酯乳剂（以下简称：植物油）是以酱油渣为原料提取植物甘油酯并乳化研制而成的生物源农药。其作用机理与矿物油相似，主要是通过物理封闭作用在害虫体表和卵外壳形成致密的油膜，阻塞害虫气门和抑制卵外壳的正常气体交换，导致生命力降低或缺氧窒息；还能够溶解和破坏细胞膜造成细胞损伤，使害虫脱水死亡[6]；此外，植物油还可以影响害虫的行为特性，干扰害虫的寄主定位，产卵等行为[7]。刘慧等[8]研究发现90%植物油蒸馏油乳剂150倍液能有效防治柑橘木虱Diaphorina citri(Kuwayama)卵、若虫和成虫，且对雌虫的产卵有拒避作用。油乳剂除了具有杀虫活性外，其形成的乳化效果可以附着在真菌孢子表面并起到保护作用，使真菌孢子免受干燥和紫外线等不良环境的侵袭[9,10]，还有利于孢子分散和施药后在植物表面及昆虫体表的附着，增强真菌孢子对害虫的杀伤效果[11]。

利用昆虫病原微生物控制害虫是生物防治的重要方法之一，昆虫病原真菌类杀虫剂具有寄主范围广、持效期长、不污染环境、不易产生抗药性以及对人类和非靶标生物相对安全等优点，具有广阔的应用前景[12]。金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae（以下简称：绿僵菌）是一类重要的生防真菌，对害虫特别是寄居于土壤中的害虫具有较强的触杀和拒食作用[13,14]，但由于其作用效果缓慢、易受环境影响等原因，在生产实践中对害虫的防控效果有限，严重制约其大面积的推广和使用[15]。如何切实有效地发挥其在杀虫过程中的优势，在害虫的可持续防控中发挥作用是目前绿僵菌使用的重点和难点。植物油乳剂在杀虫的同时，其乳化作用还可能会改善绿僵菌所处的微环境，保护并增强绿僵菌孢子对害虫的杀伤作用。目前为止，有关植物源甘油酯乳剂与绿僵菌联合使用能否显著地增强对害虫的杀伤能力仍未见报道。

黄曲条跳甲是十字花科蔬菜重要的害虫，目前主要通过喷施化学杀虫剂，调整农业种植模式，利用信息素诱杀以及生物源农药等进行防治[16-23]。但是这些防控措施结构单一、生产成本较高，且害虫易产生耐药性，从而导致黄曲条跳甲防治效果欠佳。因此，在农业生产中，需要明确各种防控措施的作用机制，整合多种手段使其达到增效减量的效果，才能更好地满足现代绿色农业发展的要求，达到控制害虫的目的[24]。本研究以农产品安全生产和生态环境友好为防治目标，探究并对比了植物油乳剂和绿僵菌以及二者混配液对黄曲条跳甲的杀伤作用，发现植物油乳剂和绿僵菌混配液对黄曲条跳甲具有显著的杀伤作用，且二者之间存在显著的协同增效作用。本研究不仅为黄曲条跳甲的绿色防控提供技术参考，同时也为利用绿色杀虫剂之间的协同增效作用，寻找更有益的绿色杀虫方法提供了有益参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试昆虫：黄曲条跳甲采集于清远未喷任何药剂的十字花科蔬菜地，并转移至广东省科学院动物研究所实验室，利用盆栽美绿菜心饲养多代。

供试菌种：金龟子绿僵菌GDIZMMa-3由自然感病的黄曲条跳甲尸首中分离，并经菌种鉴定和优化获得，菌种保存于广东省科学院动物研究所环境昆虫研究中心。菌种在PDA平板（26±1）℃，光周期14L∶10D下培养7 d，收集分生孢子粉备用。

供试蔬菜：“美绿菜心”分别在室内盆栽和田间栽种，汕头市实诚种子有限公司。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基成分为马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1000 mL。

药剂及仪器：93%植物源甘油酯乳剂（广州欧联生物科技有限公司，广东省科学院动物研究所监制）；GXZ-380智能光照培养箱（宁波江南仪器厂）；NM930-ZZM光学显微镜（深圳市晨晟光学仪器有限公司）；XB-K-25血球计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司）；16 L背负式手动喷雾器（台州市大地机械有限公司）；50 mL手持喷雾瓶（浙江三米容器有限公司）。

1.2 植物油对黄曲条跳甲成虫的毒力测定

先将植物油与去离子水按照1∶1比例振荡搅拌均匀，再稀释至50倍、100倍、200倍、400倍和800倍的供试药液，质量浓度分别为18.20、9.10、4.55、2.28、1.14 g/L。选取大小相当的菜心，每颗菜心接入20 头生育期（羽化5～10 d）和活性一致的黄曲条跳甲成虫，并用25 cm×30 cm的网袋笼罩。使用手持喷雾器进行不同植物油稀释液喷雾，喷雾量为10 mL。喷雾后，放入（26±1）℃，光周期14 L∶10 D的光照培养箱中饲养。以0.02%吐温-80无菌水为对照分别于处理后3、6、12、24、48 h统计死亡数，并计算校正死亡率及毒力。每个处理重复3次。

1.3 绿僵菌对黄曲条跳甲成虫的毒力测定

取少量绿僵菌孢子粉，放入含0.02%吐温-80的无菌水烧杯中，用磁力搅拌器搅拌，将孢子打散后用双层擦镜纸过滤，用血球计数板在显微镜下计数，测量母液的浓度，配制成2×108孢子/mL的孢子悬浮液，再依次稀释成2×108、1×108、5×107、2.5×107、1.25×107孢子/mL的孢子悬浮液备用。试虫的选取和喷雾方法同1.2。喷雾后，放入光照培养箱中饲养，培养条件同1.2。以0.02%吐温-80无菌水为对照，逐日检查（连续观察5 d）黄曲条跳甲成虫的死亡情况并计算校正死亡率及毒力。每个处理重复3次。

1.4 植物油和绿僵菌混配对黄曲条跳甲成虫的毒力测定

根据1.2和1.3试验结果，分别选取浓度为0、2×108、1×108孢子/mL的绿僵菌孢子悬浮液和0、100、300倍液植物油稀释液进行混配，以0.02%吐温-80无菌水作空白对照，对黄曲条跳甲成虫进行毒力测定。每个处理设3个重复，每个重复20头成虫。试虫的选取和喷雾方法同1.2。喷雾后，放入光照培养箱中饲养，培养条件同1.2。分别于处理后2、4、6、8、12、16、20、24 h统计死亡数，并计算校正死亡率及毒力。每个处理重复3次。

1.5 植物油和绿僵菌混配对黄曲条跳甲的田间防效

田间药效试验在广州国家现代农业产业科技创新中心的菜心样地进行。田间试验设4个处理：清水、1×108孢子/mL绿僵菌孢子悬浮液、100倍液植物油、100倍液植物油＋1×108孢子/mL绿僵菌孢子悬浮液。每个处理重复3次，每小区面积为28 m2（4 m×7 m），每小区喷施药液2 L，各小区之间留1垄不做任何处理，作为缓冲保护区。所有小区均使用工农16 L型手动背负式农用喷雾器均匀喷洒。试验期间不使用其他杀虫剂，各小区田间管理与其他菜地一致。

采用5点取样法调查各小区黄曲条跳甲成虫的数量，每点调查5株。施药前一天调查1次，施药后第2、4、6、8 d各调查1次。分别记录每株菜心黄曲条跳甲成虫的数量。根据统计结果计算虫口密度(虫数/百株)、虫口减退率和相对防效。

1.6 数据统计与分析

试验数据采用Excel 2010、SPSS19.0软件进行统计分析。计算死亡率和校正死亡率；毒力回归方程、LT50及其95%置信限等参数；利用单因素方差分析对虫口减退率、相对防效、死亡率和校正死亡率试验数据进行分析，并采用Duncan氏新复极差法比较两组处理之间的差异显著性；利用多因素方差分析测定植物油、绿僵菌、作用时间对黄曲条跳甲成虫死亡率影响。死亡率＝死亡虫数/供试虫数×100%；校正死亡率＝（处理组的死亡率―对照组的死亡率）/（1―对照组的死亡率）×100%；虫口减退率＝（处理前处理虫量―处理后处理虫量）/处理前处理虫量×100%；相对防治效果＝1―（处理前对照虫量×处理后处理虫量）/（处理后对照虫量×处理前处理虫量）×100%。

2 结果与分析

2.1 植物油对黄曲条跳甲成虫的毒力

不同稀释倍数的植物油对黄曲条跳甲成虫的毒力测定结果见表 1。在喷施不同稀释倍数的植物油 2 d时，黄曲条跳甲成虫的校正死亡率随着供试植物油浓度升高而显著增加（F＝64.90，P＜0.001）。毒力测定表明：随着植物油稀释倍数的增加，黄曲条跳甲成虫的致死中时（LT50）逐渐延长（F＝69.21，P＜0.001）。以上结果表明，不同浓度的植物油对黄曲条跳甲成虫毒力具有显著差异，且LT50随着植物油浓度的增加而明显缩短。

表1 不同浓度植物油对黄曲条跳甲成虫的毒力Table 1 Toxicity of different concentrations of plant spray oil to P.striolata adult

2.2 绿僵菌对黄曲条跳甲成虫的毒力

不同浓度绿僵菌孢子悬浮液对黄曲条跳甲成虫的毒力测定结果表明，黄曲条跳甲成虫的累计死亡率随着绿僵菌孢子浓度和孢子的作用时间的增加而上升（图 1），致死中时随着绿僵菌孢子浓度增加而显著降低（F＝12.34，P＝0.007，表2）。当绿僵菌孢子悬浮液浓度较高时（2×108孢子/mL），杀虫效果最好，在施药第2 d时其死亡率显著高于对照组（F＝71.10，P＜0.001），在第5 d时，黄曲条跳甲成虫的死亡率和校正死亡率均高于 90%（表 2）；当绿僵菌孢子浓度较低时（1.25× 107孢子/mL），其对黄曲条跳甲成虫的防治效果降低，且杀虫效果与绿僵菌的作用时间相关，其死亡率在4 d以后会显著高于对照组（4 d，F＝72.24，P＜0.001；5 d，F＝49.38，P＜0.001）。

表2 不同浓度绿僵菌对黄曲条跳甲成虫的毒力Table 2 Toxicity of different concentrations of M.anisopliae to P.striolata adult

图1 不同孢子浓度下绿僵菌对黄曲条跳甲成虫的作用时间-死亡率比较Fig.1 Comparison of time-mortality relationship M.anisopliae on P.striolata adult inoculated with spores at varied concentrations

2.3 植物油和绿僵菌混用对黄曲条跳甲成虫的毒力

根据2.1和2.2的试验结果，选取植物油100倍液、300倍液与绿僵菌浓度2×108、1×108孢子/mL分别进行混配，测定混配液对黄曲条跳甲成虫的毒力。结果表明，植物油和绿僵菌混配液对黄曲条跳甲成虫控制作用显著，黄曲条跳甲成虫在同一时间的累计死亡率均高于植物油和绿僵菌单剂处理（图 2），24 h的校正死亡率大于95%（表3）。多因素方差分析结果表明，植物油和绿僵菌的作用时间会显著地影响黄曲条跳甲成虫的死亡率，但短时间内绿僵菌对黄曲条跳甲成虫的死亡影响较小。多因素方差分析的交互结果显示，绿僵菌和植物油具有显著的交互作用，能够增强对黄曲条跳甲的防控效果（表4）。

表3 植物油和绿僵菌混用对黄曲条跳甲成虫的毒力Table 3 Toxicity of plant spray oil mixed with M.anisopliae to P.striolata adult

表4 植物油、绿僵菌及时间的相互作用对黄曲条跳甲成虫死亡率影响的多因素方差分析Table 4 Multi-factor variance analysis of mortality P.striolata adults in the treatments of plant spray oil with M.anisopliae

图2 植物油和绿僵菌混用对黄曲条跳甲成虫作用时间-死亡率比较Fig.2 Comparison of P.striolata adult time-mortality relationship in the treatments of plant spray oil with M.anisopliae

2.4 不同处理对黄曲条跳甲成虫的田间防治效果

根据室内试验的结果，通过田间试验进一步测试了植物油和绿僵菌以及二者混配液对黄曲条跳甲成虫的防控效果（图 3）。为降低试验误差，试验开始前统计了各小区的黄曲条跳甲成虫的种群密度，结果显示各小区黄曲条跳甲成虫数量基本一致，保证了后续结果的一致性。对比植物油和绿僵菌以及二者混配液对黄曲条跳甲成虫的控制作用结果表明，植物油和绿僵菌混配液对黄曲条跳甲成虫具有较强的杀伤作用显著高于两种单剂，并且混配液对黄曲条跳甲成虫种群的增长具有持续控制的效果（2 d，F＝65.70，P＜0.001；4 d，F＝332.08，P＜0.001；6 d，F＝343.83，P＜0.001；8 d，F＝641.55，P＜0.001）。通过分析不同药剂处理后黄曲条跳甲成虫的种群密度变化情况可以看出，喷施植物油后会较快地降低黄曲条跳甲成虫的种群密度；绿僵菌对黄曲条跳甲成虫的防控起效慢，但持续时间长；植物油和绿僵菌的混配液可以快速控制黄曲条跳甲成虫种群密度同时在后期能够持续地降低黄曲条跳甲成虫种群（图3A）。进一步的分析表明，植物油和绿僵菌的混配液前期主要是植物油起作用，而后期长时间的持续控制作用主要是绿僵菌起作用。

为进一步评价上述三种药剂对黄曲条跳甲成虫的防控效果，试验计算并比较了三种药剂处理的相对防效和虫口减退率（图3B和图3C），与黄曲条跳甲成虫种群密度变化一致，植物油和绿僵菌混配液对黄曲条跳甲成虫的相对防效和虫口减退率显著高于植物油和绿僵菌单剂处理（8 d：相对防效，F＝93.30，P＜0.001；虫口减退率，F＝322.20，P＜0.001）。植物油对黄曲条跳甲的防治速度快，后期相对防效变化不大；绿僵菌孢子悬浮液对黄曲条跳甲成虫的防治效果较低且作用缓慢，但持效期长，而植物油和绿僵菌混和施用可以显著提高对黄曲条跳甲的防治效果，弥补植物油和绿僵菌防治过程中的缺点。

图3 田间施用绿僵菌、植物油和混合施用对黄曲条跳甲成虫的田间防效Fig.3 Field control efficacy of P.striolata adult after spraying of M.anisopliae, plant spray oil and their mixture in the field

3 讨论

利用绿色安全的杀虫剂防治蔬菜害虫不仅能保证食品的安全生产，同时也会降低农药残留和对环境的污染，综合利用和探究各绿色杀虫剂之间的协同作用，可为新型农药的开发以及防控田间害虫提供新的方法和手段。植物源甘油酯（植物油）和绿僵菌均为农业生产过程中常用的绿色无公害杀虫剂，但其二者混配后使用是否可以增加对害虫的防控效果仍缺乏相关研究。本试验测试了植物油和绿僵菌以及二者联合使用对黄曲条跳甲成虫的防控作用，结果表明植物油和绿僵菌混配液可以增强各自的杀虫和防控效果，同时混配液还可以显著地延长对黄曲条跳甲成虫的控制时长。

植物油是从发酵食品中提取的新型植物油脂，具有在环境中易降解、生产成本低、对天敌安全、害虫不会产生抗药性等特点，对小型害虫和一些叶面微生物病害的防控起重要作用[8]。例如，臭氧化植物油具有杀菌和愈合伤口的功效，可用于苹果腐烂病的防治[25]；蓖麻油可用于田间小菜蛾Plutella xylostella(Linnaeus)幼虫防治，且会拒避小菜蛾成虫产卵[26]。该试验的室内结果表明，植物油可以用于防控黄曲条跳甲成虫且对黄曲条跳甲成虫杀伤作用会随着植物油浓度的增加而增大，并且100倍液植物油稀释液对黄曲条跳甲成虫的杀伤作用高于90%，且致死中时显著降低，但田间试验过程中发现植物油的杀伤作用低于室内效果，这可能与田间环境变化相关。

绿僵菌是广泛分布于自然界中的一类重要的昆虫病原真菌。目前已用于防治甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Hübner)、褐飞虱Nilaparvata lugens(Stål)、蝗虫等害虫[14]，但其杀虫效果相对较慢，在施药初死亡率较低，受环境影响较大[27-29]。本文测试了绿僵菌在室内对黄曲条跳甲成虫的防治效果，发现低浓度绿僵菌对黄曲条跳甲成虫的杀伤作用较低，高浓度下对黄曲条跳甲成虫的杀伤效果明显，但其杀虫速度缓慢，远低于植物油的防控效果和速度。田间试验表明，高浓度的绿僵菌对黄曲条跳甲的防控起效时间慢，但持效期长，这可能由于绿僵菌可以一定程度上在施药后增殖，能够长期存活在环境中并侵染害虫有关。

室内和田间的试验结果表明，植物油和绿僵菌的混配液对黄曲条跳甲成虫的防控效果均显著高于两种单剂，并且多因素方差分析结果显示植物油和绿僵菌具有显著的相互作用。二者的混配液可能改变了制剂的性状，进而增强了杀虫效果。已有的研究显示，植物油不仅可以通过覆膜直接杀死害虫，其还具有乳化作用，可作为助剂协助其他农药在生物体表面上的展布、润湿和沉积，增加农药在植物表面的渗透和覆盖面，达到增效的作用[6]。植物油和绿僵菌混配可能会增强绿僵菌的粘着力和渗透性，使其更易侵入寄主。此外，植物油乳化后会在接触面形成油膜，形成的微环境可以抵御紫外线、高温、干燥等不良环境，延长了孢子的存活时间，使其能顺利萌发和侵染；同时植物油在昆虫体表形成致密的油膜，还可能会改变害虫生理代谢以及免疫活性等，由此增加了真菌孢子的侵染活力，这些仍需进一步的探究。

对比植物油和绿僵菌混配液与两种单剂在田间的防控效果发现植物油和绿僵菌混配液在杀虫前期主要是植物油起到杀虫作用，而绿僵菌可以持续的降低害虫的种群密度，增强药效的持续时间，弥补植物油施用后期杀虫效果的不足。二者的混配液不仅可以降低各自在害虫防控中的缺点，达到协同增效作用，同时还可以降低田间的施药频次。对比其他常见的黄曲条跳甲防治药剂，植物油和绿僵菌混配液第8 d的相对防效高达89.80%，显著高于普通药剂，同时植物油和绿僵菌的混配液不会引起害虫的抗药性，并且对人类健康和对环境友好是理想的绿色防控药剂。

病虫害的绿色防控是近些年来对害虫防治过程中的理念，通过综合利用各种手段以及绿色农药控制病虫害的发生。在使用过程中发现大多数的绿色农药普遍杀虫效果不好，导致绿色农药的推广和使用受到限制，探究绿色农药之间的相互作用，增强绿色农药的杀虫效果，有利于其使用和推广，但目前这些研究仍然较少。本试验证实了植物油与绿僵菌组合对黄曲条跳甲成虫的防控具有协同增效作用，不仅增加了黄曲条跳甲的绿色防控手段同时也为其他害虫的防控提供了依据，该研究还为利用绿色农药间的协同作用控制病虫害提供了案例，同时在绿色食品生产，农药减量增效和生态环境保护等方面具有重要的指导意义。