转基因抗虫玉米对节肢动物多样性影响研究进展

马 月，刘 娜，谢彦博，梁晋刚，李飞武*

（1.吉林省农业科学院，长春 130033；2.农业农村部科技发展中心，北京 100176）

玉米是我国最重要的粮食作物之一，2020年播种面积达6.2亿亩，占全国粮食作物总面积的35.3%，占世界玉米种植总面积的20.4%；我国玉米总产占粮食总产量的39%，占世界玉米产量的22.4%[1]。因此，玉米生产在保障我国粮食安全方面占据极其重要的地位。亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis、棉铃虫Helicoverpaarmigera、粘虫Mythimna seperata等鳞翅目害虫是制约玉米生产的一个重要因素，常年发生面积2000万hm2以上，每年可造成玉米减产10%以上，重发年份产量损失达50%以上，草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda已经入侵我国南方玉米区并逐年北扩，严重影响我国玉米生产[2]。

从害虫防治技术的成效来看，化学防治易产生抗药性且对环境不够友好，生物防治见效较慢，由于玉米种质资源中缺少抗鳞翅目害虫的遗传资源，利用常规育种技术也很难突破。转基因抗虫玉米的诞生为控制玉米害虫开辟了新途径[3]。自1996年首例转基因抗虫玉米商业化种植以来，抗虫性成为转基因玉米研发最重要的性状之一，2019年抗虫转基因玉米在全球种植了5590万hm2，占转基因玉米面积（6090万hm2）的91.8%[4]，截至2022年5月，全球共有119个具有抗虫性状的转基因玉米转化体获得商业化应用许可，占获批玉米转化体的78.3%[5]。2019年以来，我国发放了11个转基因玉米生产应用安全证书，其中8个包含抗虫性状，另外3个作为抗虫玉米的庇护所材料[6]。

转基因抗虫玉米在为人类带来诸多利益的同时，也可能存在一些潜在的生态风险，如基因漂移、杂草化、对农田生物多样性造成影响等，特别是对非靶标节肢动物生长发育及其田间种群多样性的影响一直是抗虫玉米环境安全评价研究的重点[7]。为加强转基因生物安全管理，保障转基因技术有序发展，我国制定了一系列严格的法律法规、政策文件、评价指南和检测标准，对转基因作物环境释放进行严格监管。其中，对农田生物及其种群多样性影响的检测评价是转基因作物环境安全评价体系中至关重要的环节。本文重点围绕转基因抗鳞翅目害虫玉米，介绍了抗虫玉米对靶标害虫及非靶标生物多样性影响的研究进展。

1 对农田生态系统节肢动物多样性的研究方法

1.1 对靶标害虫及特定非靶标生物的研究方法

1.1.1 田间原位试验 田间原位试验能真实反映转基因抗虫玉米推广后对靶标害虫的控制效果和对非靶标生物的影响程度，主要包括人工接虫法和自然观察法。人工接虫法是通过小区试验人为增加虫口密度和虫害选择压，鉴定抗虫玉米对靶标害虫的田间抗性，对玉米螟、粘虫、棉铃虫等鳞翅目靶标害虫通常在玉米虫害发生的关键时期（如心叶期、吐丝期）进行人工接虫，接虫2～3周后调查玉米被害情况。心叶期接虫主要调查叶片被取食情况，吐丝期接虫主要调查雌穗被害程度以及植株被害情况（如蛀孔数量、蛀孔隧道长度等），从而判定抗虫玉米对各种靶标害虫的抗性水平。人工接虫法受气象因素影响较大，接虫时遇高温、大雨等均会影响接虫效果，一般需间隔3～7 d重复接虫，以确保鉴定结果准确[8]。

自然观察法是在不施加人为选择压的自然条件下，调查靶标害虫发生情况及对玉米植株的为害情况，以及非靶标生物的种群发生情况，进而评估转基因抗虫玉米的田间防控效果，探究非靶标生物的生态功能、种群动态等是否受到抗虫玉米的影响[9,10]。

1.1.2 室内生测试验 与田间原位试验相比，室内生物测定能在更加精确可控的条件下鉴定抗虫玉米对靶标和非靶标生物的生长发育影响，且不受天气影响。对鳞翅目靶标害虫的室内生测，通常以心叶期的心叶、吐丝期的未授粉花丝、灌浆期的籽粒为试验材料，饲喂靶标害虫的初孵幼虫，依据受试害虫存活率判定抗虫玉米的抗性水平。

除了测定靶标害虫抗性，室内生测方法还是评估转基因抗虫玉米对传粉昆虫、捕食性或寄生性天敌、植食性昆虫、土壤中扮演分解者角色的节肢动物等非靶标生物影响的优选手段，这些物种一方面具有不同生态功能，另一方面在自然条件下会暴露于抗虫玉米表达的杀虫蛋白且有可能受该蛋白影响[7]。以杀虫蛋白或抗虫植物组织器官饲喂龟纹瓢虫Propylea japonica、草蛉、二斑叶螨Tetranychus urticae等非靶标生物的室内生测方法已形成一系列国家标准，应用于转基因抗虫玉米的环境安全评价[11-13]。

1.2 对玉米田节肢动物多样性的研究方法

节肢动物作为农田生态系统的重要组成部分，对维持农田生态系统的稳定起着至关重要的作用。按照现行有效的国家标准，转基因抗虫玉米对田间地上节肢动物多样性影响的调查研究方法主要有3种：直接观察法、吸虫器法、陷阱法。直接观察法由调查人员在田间现场通过肉眼观察玉米植株及其地面各种节肢动物的数量、种类和发育阶段，其技术要点是需快速记录活泼易动的昆虫和蜘蛛的种类及数量；吸虫器法通过借助吸虫器的吸力，抽取玉米全株及其地面1 m2范围内的所有节肢动物，带回室内分类鉴定；陷阱法通过在试验小区内埋设装有洗涤剂水的塑料杯，调查杯中收集到的节肢动物种类和数量。依据调查到的节肢动物种类及其数量，计算群落多样性指数、均匀性指数和优势集中性指数3个指标，进而分析抗虫玉米对田间节肢动物多样性的影响。从近20年的环境安全检测实践来看，上述3种节肢动物多样性调查方法各有优缺点（表1），为增加试验结果的可靠性，通常会选用两种或两种以上的调查方法。

表1 三种调查方法的优缺点Table 1 Advantages and disadvantages of the three survey methods

2 抗虫玉米对生物多样性的影响

2.1 对靶标害虫抗虫性的有效性评价

2.1.1 试验条件下对靶标害虫抗性效果显著 目前，转基因抗虫玉米中应用频次最高的抗虫基因主要源于苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）[14]。转Bt基因玉米因其能够高效表达杀虫蛋白，精准、快速杀死靶标害虫，而受到了广大种植者的欢迎[15]。抗虫性评价是抗虫玉米研发与应用中的必要环节，通常采用田间人工接虫与室内生测相结合的方法进行综合评估。

通过室内生测和田间接虫试验评价Bt玉米MON810对亚洲玉米螟的抗虫性，结果显示Bt玉米对亚洲玉米螟达到高抗，具有控制一代和二代亚洲玉米螟的潜力[16]。采用同样的方法测试我国自主研发的转基因抗虫玉米的靶标害虫抗性，结果显示，GAB-3玉米（表达Cry1Ab和Cry2Ab蛋白）对粘虫、亚洲玉米螟、棉铃虫、草地贪夜蛾都有着很好的杀虫效果[17]；瑞丰 125（Cry1Ab/Cry2Aj）、DBN9936（Cry1Ab）和 DBN9978（Cry1Ab）对亚洲玉米螟有很高的杀虫活性和田间防控效果[18]。

2.1.2 自然条件下主要鳞翅目害虫种群显著下降 与人工接虫的方法相比，在自然条件下的抗虫性评价能够客观地反映出在实际生产中转基因抗虫玉米对靶标害虫的抗性水平。在多个试验地点发现，自然条件下Bt玉米DBN9936处理中的玉米螟、棉铃虫等鳞翅目害虫数量明显少于对照处理，Bt玉米穗部和茎秆遭受害虫为害程度都显著低于非Bt玉米，对靶标害虫表现出很好的田间抗性[19,20]。在双抗12-5、HGK60等其他国产转基因抗虫玉米成熟期，通过剖穗、剖杆调查也得到了相似的自然条件下的抗性结果[21,22]。

国外产业化应用的教训表明，若抗虫玉米对靶标害虫的杀虫效果未达到高抗水平，在田间可能很快产生抗性[23]。因此，为延缓靶标害虫抗性产生、保障转基因抗虫产品的可持续发展，需要在品种推广前通过抗虫性研究筛选出高抗品种，并在推广后持续进行抗性监测，并因地制宜采取有效的抗性治理措施[24,25]。

2.2 对非靶标节肢动物的影响

2.2.1 天敌昆虫 瓢虫和草蛉是玉米田间常见天敌昆虫，它们可通过取食Bt玉米花粉或捕食以Bt玉米为食的害虫，从而暴露于杀虫蛋白中。早期一些研究都是通过这样的二级营养关系或三级营养关系来探究抗虫玉米对瓢虫、草蛉生长发育的影响，近些年，有学者认为通过Tier-1试验得到的研究结果更加可靠[26]。

将Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Aa、Cry1Ah、Cry1F等不同杀虫蛋白混入人工饲料中，研究Bt蛋白对日本通草蛉Chrysoperla nipponensis、大草蛉Chrysopa pallens幼虫生长发育的影响，均未发现这些杀虫蛋白对草蛉存活率、化蛹率、幼虫发育时间、成虫羽化率等造成不利影响[27,28]；Cry2Ab蛋白对不同龄期龟纹瓢虫的影响研究显示，与添加蔗糖的对照相比，其发育历期、雌雄比、体质量等均无明显差异[29]。也有研究人员采用田间观察法调查抗虫玉米种植对天敌昆虫种群的影响，发现抗虫玉米HGK60及其对照田间的瓢甲科和草蛉科种群发生较为一致，仅极个别调查时期抗虫玉米与对照存在差异[22]。本实验室通过对瑞丰125、DBN9936、MON89034等抗虫玉米的多样性研究发现，瓢虫和草蛉在转基因玉米田中的发生情况与对照玉米田相比，无论是数量还是发生趋势基本保持一致，两者均在玉米生长中后期数量达到峰值，没有表现出显著差异。

2.2.2 传粉昆虫 蜜蜂是农田生态系统中常见的传粉昆虫，也是重要的经济昆虫，主要以作物的花粉、花蜜等为食。而Bt杀虫蛋白在花粉中可以表达，蜜蜂在采集、取食花粉的过程中就会直接摄取杀虫蛋白，因此，蜜蜂是抗虫玉米环境安全评价的重要指示物种[30]。

Malone等[31,32]持续探究了Cry1Ba蛋白对西方蜜蜂Apis mellifera成虫的影响，结果表明，取食混入Cry1Ba蛋白的花粉对蜜蜂存活率、寿命及食物消耗速度均无明显变化。在实验室和田间条件下研究Bt玉米花粉对蜜蜂生长发育的影响，发现在实验室处理35 d后Bt玉米花粉对蜜蜂的体质量和存活，在田间处理28 d后Bt玉米花粉对蜜蜂体质量、觅食能力和种群发展等没有不利影响[33]。为更深入了解杀虫蛋白是否影响蜜蜂的发育，Babendreier等[34]还研究了Bt花粉和Bt蛋白对工蜂王浆腺的发育以及肠道微生物的影响，虽然在王浆腺中能够检测到少量 Bt蛋白，但其对王浆腺的发育及肠道细菌群落均无不利影响。在蜜蜂取食低浓度的杀虫蛋白或花粉时，蜜蜂的学习行为和采集行为均不受影响，但取食高浓度杀虫蛋白时，蜜蜂吻的伸长行为和取食行为会受到显著影响[35]。与非转基因花粉处理相比，表达Cry1Ab/Cry1AcZM融合蛋白的抗虫玉米花粉对蜜蜂生命表各项参数，如蜜蜂存活率、咽下腺腺泡直径等均未产生显著影响[36]。使用高于最大暴露量的Cry1C、Cry2A等杀虫蛋白喂饲蜜蜂，同样未发现对蜜蜂幼虫产生急性毒性[37]。

2.2.3 经济昆虫 帝王蝶Danausplexippus是北美常见的观赏昆虫，曾在转基因抗虫玉米环境安全评价领域引发争论，因此常作为抗虫玉米对非靶标生物影响评价的重要指示性物种。实验室研究显示，与非转基因花药处理相比，暴露于0.3个花药/cm2处理的帝王蝶幼虫体质量下降，且影响程度随花药密度增加而加剧；暴露于0.9个花药/cm2处理的帝王蝶幼虫死亡率上升，发育历期延长，但后期幼虫对Bt蛋白的耐受性会增加。结合田间调查来看，Bt玉米田附近的马利筋杂草上花药密度约为0.06～0.1个花药/cm2，远低于实验室引起负面效应的浓度，田间原位测试结果也显示，帝王蝶幼虫取食蘸有0.1个花药/cm2的叶片，未发现对其生长发育和存活率产生影响[38]。其他同类研究也表明，尽管在实验室检测到抗虫玉米对帝王蝶产生影响，但需要结合后者在自然条件下实际暴露于 Bt杀虫蛋白的程度进行综合评价[39]。采用室内毒性试验评价RNAi抗虫玉米中发挥杀虫作用的dsRNA对帝王蝶幼虫的影响，摄入dsRNA不会对帝王蝶存活率和发育时间产生影响[40]。

家蚕Bombyx mori是我国南方地区重要经济昆虫，一方面桑树种植区与转基因抗虫玉米种植区存在重合可能，导致Bt花粉飘落到桑树上，进而使家蚕暴露于Bt蛋白中，另一方面家蚕与亚洲玉米螟、粘虫等抗虫玉米的靶标害虫同属鳞翅目，因此国内十分关注转基因抗虫玉米是否会对家蚕造成不利影响。在自然条件下，家蚕主要通过花粉漂移而接触到杀虫蛋白，因此在评价抗虫玉米对家蚕的影响时，要考虑桑叶上的花粉密度。在表达 Cry1Ab/Cry2Aj、Cry1Ab/Vip3DA、Cry1Ab/Cry1I三种转基因抗虫玉米花粉对家蚕的研究中，当桑叶上花粉密度约100粒/cm2时，Bt花粉不会影响家蚕的生长发育，但当花粉密度增加10倍时，家蚕的各龄眠蚕体质量减轻，发育历期延长，而当花粉密度增加100倍，家蚕全部死亡[41]。目前关于玉米花粉在桑树上的沉积数量还没有确切数据，但在与玉米地紧邻的荨麻上，玉米花粉密度可达100粒/cm2，与玉米地相距超过10 m就会下降至10粒/cm2以下[42]，并且花粉漂移也会受到气候、地形等因素的影响，Bt玉米花粉在桑树上的实际沉积数量通常远远少于实验室供试密度，因此通过Bt花粉漂移途径对家蚕的影响比较小。

转cry1Ab基因玉米花粉与对照相比，对各龄期家蚕的死亡率、蛹重、茧重、化蛹率、羽化率等均无显著影响[43]。不同类型的 Bt蛋白对家蚕的毒性各异，Cry1C、Cry1Fa、Cry1B、Cry2A、Cry1Ab、Cry1Ac等常见的6种Bt杀虫蛋白对家蚕的毒性依次减弱[44]，进而印证了前期的一些研究。目前Bt抗虫玉米中应用最广的是Cry1Ab，如MON810、Bt11等，我国自主研发的抗虫玉米双抗12-5、DBN9936、ND207也是采用的 Cry1Ab。但随着不同杀虫机理的新型抗虫基因及抗虫玉米新品系不断被研发，还需要科学、谨慎地评估其对家蚕的风险。在抗虫玉米产业化布局时，还应做好与桑蚕产业的相对隔离，尽量规避风险。

2.2.4 土壤动物 土壤是生态系统中物质循环和能量转化的重要场所，土壤动物作为土壤生态系统的重要组成部分，是评价土壤质量的重要指标[45]，转基因抗虫玉米的杀虫蛋白可通过植株残体、花粉、根系和根系分泌物等途径进入土壤[46]，对土壤动物是否造成影响已越来越多地受到关注。

跳虫是土壤动物中主要的类群之一，种群数量庞大，喜欢在作物根系附近活动，参与农作物残体的降解，在种植抗虫玉米的土壤中跳虫会暴露在杀虫蛋白下，因此跳虫可作为研究抗虫玉米对土壤动物影响的指示性物种[47]。通过研究Bt玉米植株残体降解过程及其是否会引起跳虫群落多样性的变化，发现Bt玉米残体的降解与对照没有显著差异，对跳虫群落多样性也无统计学意义上的影响[48]。用 Bt玉米叶片饲喂白符跳Folsomia candida，其存活率和繁殖率与非转基因对照组相比未见显著影响[49]。田间群落多样性调查研究也进一步证明，表达 Cry1Ac、Cry1Ie等杀虫蛋白的抗虫玉米对弹尾目节肢动物群落不会产生显著影响[50,51]。

蚯蚓也是土壤生态系统中的重要类群，具有加速分解有机质、促进C、N营养循环、改良土壤、提升土壤肥力等作用，是评价土壤健康的重要指示动物。通过在抗虫玉米叶片和根系残体中加入蚯蚓，探究Cry1Ab蛋白降解及对蚯蚓的影响，发现蚯蚓能促进Cry1Ab蛋白的降解，但Bt蛋白对蚯蚓存活率没有显著影响[52]。在种植Bt玉米的土壤或用Bt玉米残体改良的土壤中饲养蚯蚓，可在蚯蚓体内检测到Bt蛋白，但将蚯蚓转移出含Bt蛋白的土壤2～3 d后，就检测不到Bt蛋白了，并且其重量和存活率与对照相比均无差异[46]。

2.2.5 非靶标害虫 在农田生态系统中，由于抗虫作物的长期种植，使得化学杀虫剂的使用频次和用量减少，非靶标害虫可能会演化成转基因玉米田间的主要害虫，并对玉米产业造成新的为害，因此也有必要研究抗虫玉米对非靶标害虫的影响，并根据实际情况采取相应的防控措施[53]。

玉米蚜Rhopalosiphum maidis通过聚集于叶片并刺吸植株汁液而造成玉米生长受抑，而且可传播玉米矮花叶病毒MDMV、玉米叶斑病毒MLSV等引发病害，造成玉米减产[54]。目前应用最广的转Bt基因抗虫玉米对蚜虫不表现出抗性，有多项研究将蚜虫作为非靶标害虫进行Bt蛋白和Bt玉米的评价。无论是在人工饲料中添加Vip3Aa19、Cry1Ab、Cry1Ah等不同Bt蛋白，还是直接用Bt玉米植株进行接虫试验，均未发现Bt蛋白或Bt玉米对玉米蚜的存活率、生长发育、繁殖能力等存在显著影响[55,56]。在RNAi类抗虫玉米的田间节肢动物多样性研究试验中，与常规对照相比，抗虫玉米对蚜虫、蓟马等植食性非靶标害虫的种群丰度也没有明显影响，与在Bt抗虫玉米上的结果一致[57]。本实验室在田间节肢动物多样性调查中发现，蚜虫在转基因抗虫玉米与非转基因对照上的发生数量均较大，且种群数量发生发展趋势基本一致，无显著差异。此外，在我国玉米主产区，双斑萤叶甲Monolepta hieroglyphica、赤须盲蝽Trigonotylus ruficonis、蓟马等 Bt玉米的非靶标害虫也时常发生，有的年份发生量比较重，对玉米生产造成为害，然而有关转基因抗虫玉米对双斑萤叶甲等非靶标害虫影响的研究还鲜有报道，有必要结合玉米生产需求，开展进一步的室内研究和田间监测，为非靶标害虫的地位演化提前制定防控对策。

3 展望

从现有的关于转基因抗虫玉米对节肢动物多样性影响的研究结果来看，无论是田间试验、室内生测，或是规模化生产种植，抗虫玉米对其主要靶标害虫均表现出具有很好的防治效果，而对天敌昆虫、传粉昆虫、经济昆虫、土壤动物等代表性非靶标生物的生长发育、种群发生等均没有表现出比非转基因玉米更明显的影响，证明其生态安全性是得到保障的[58]。国内也鉴定出了一系列自主研发的高抗玉米螟、粘虫等鳞翅目害虫的抗虫玉米品种，为国产抗虫玉米产业化奠定了基础。当然，国内由于尚未放开抗虫玉米商业化种植，目前开展的都是根据现有杀虫蛋白进行的室内试验或者田间的小规模试验，一旦开放抗虫玉米种植后，还需在更大的尺度上开展以个案分析为原则的生物多样性影响研究。特别是在安全评价制度调整为以转化体为对象后，对由已获安全证书的抗虫玉米转化体转育的衍生品种，在推广前需进行对靶标害虫的抗性鉴定，确保进入生产的抗虫品种具备高抗特性。此外，目前抗虫玉米对非靶标生物影响的评价技术和标准，几乎都是针对表达杀虫蛋白的传统转基因产品，而对RNAi干扰等不表达杀虫蛋白的新型转基因抗虫玉米，如何建立实验室内非靶标生物评价体系，制定相应的技术标准，随着RNAi干扰产品的不断研发，也需开展深入研究，

自 2002年《农业转基因生物安全评价管理办法》实施以来，我国针对不同抗虫玉米转化体开展大量环境安全检测评价工作，对节肢动物多样性影响进行了系统研究。从现行调查方法来看，直接观察法贯穿整个玉米生长期，调查次数过于频繁，数据量很大，而其反映的结果大致趋同。吸虫器法在玉米生长的关键时期进行调查，调查时期比较有代表性，但在实际操作中存在吸虫器操作不便、损伤虫体等问题，并且收集到的节肢动物种类大多是一些体型较小的昆虫，如蚜虫、蝇、蚊、蜘蛛、瓢虫等，与直观法和陷阱法中得到的种类相近，对整体的试验数据并没有起到很好的补充作用。从近 20年转基因作物环境安全检测评价实践来看，有必要对相关技术标准中的节肢动物多样性研究方法进行优化改进，按照玉米生长发育阶段及主要节肢动物种群的发生规律，选择具有代表性的调查时期和更恰当的调查方法，优化调查频次及调查对象，使田间试验研究更加精细化、可操作性更强，结果更具代表性。

从转基因作物商业化应用的成功经验来看，抗虫作物不仅可以便捷高效地控制靶标害虫，而且能显著减轻因虫害引发的真菌感染，降低真菌毒素含量，提高产品质量，为农田生态环境保护、社会经济、人类健康等带来诸多益处[59,60]。例如，Bt棉在我国的推广有效控制了棉花上的棉铃虫种群数量，也使得其在玉米、大豆、花生、蔬菜等其他非 Bt寄主作物上的发生数量相应减少，从而降低了当地对杀虫剂的需求总量[61]。但我们也要清晰地认识到，抗虫作物推广后也会产生一些衍生性的生态问题，比如随着 Bt棉的广泛种植，盲蝽蟓逐渐演化成为 Bt棉田中的主要害虫[62]。由此可见，转基因抗虫植物的推广应用不是一劳永逸的，需要预判随之出现的新的生态环境风险，持续加强相关检测监测和评价研究，并提前制定好切实可行的应对方案，既有序推进转基因抗虫作物的产业化，又保障生态安全。