环烯醚萜类成分生物合成途径及关键酶基因探究

江舟，姚新成

（云南中医药大学，云南昆明 650500）

环烯醚萜作为重要成分存在于众多中草药中，具有降糖、抗炎以及抗肿瘤等药理活性。环烯醚萜由多种化合物结构组成，其作用机制以及生物活性也各不相同。一般环烯醚萜类化合物骨架有三大类，分别为环烯醚萜苷类、裂环烯醚苷类、环烯醚萜乙缩醛酯类，所以环烯醚萜基本骨架通过羟基化、环氧化以及通过莽草酸途经可获取芳香酸酯化，在芳香酸酯化驱动下形成不同形式的环烯醚萜[1]。环烯醚萜类化合物结构多样，植物环烯醚萜类化合物则会受其多样性结构影响，其自身涵盖的生物活性相对广泛。当前国内外鲜少探究环烯醚萜类成分生物合成途径及其关键酶基因，对此，从多方研究归纳环烯醚萜类成分，了解其生物合成途径和关键酶基因，旨在预测未知活性的其他环烯醚萜类化合物，为研究开发高活性新型环烯醚萜类药物奠定基础。

1 环烯醚萜类成分概述

环烯醚萜醇涵盖环状烯醚与醇羟基，更是环烯醚萜类化合物母核。其中醇羟基是一种性质活泼以及易与糖相结合的半缩醛羟基，所以，基本以苷形式组成环烯醚萜并存于天然环境内，该物质中占据较大比例的组分为D-葡萄糖苷。相关实验证实，C4-CH3经氧化易分解为-COOH、-CH2OH、-COOR 等成分，若分解为-COOH，通过脱羧后则演变为降解形式的环烯醚萜类化合物。同时，C8-CH3也易氧化分解为-CH2OH 与-COOH 等。此外，部分处于分子中的环戊烷以不同形式氧化状态呈现，而C5-6、C6-7、C8-9三者间会转化成双键，C6-7为环酮结构，CC7-C8则会形成环氧结构[2]。具体有以下3 类：

1.1 环烯醚萜苷类

此类骨架组成本质为环烯醚萜类，唯一不同的参与此骨架的还有裂环环烯醚萜。环戊烷结构单元存在于环烯醚萜苷类母核中，与此同时，五元环与单一环烯醚环生成环烯醚萜苷类化合物。存在于可取代基五元环的C6、7、8，C6-C7，C8-C9，C9-C10可作为单双键。C1位上则具有甲氧基和羟基等取代基，与此同时，C1为半缩醛羟基形式，经常与D-葡萄糖组成苷键，该结构体系中，葡萄糖C6上羟基及其他基团多以酯基形式存在。在深入研究环烯醚萜类化合物中会持续发现全新的环烯醚萜类结构，例如在抱茎獐牙菜中可分离获取到senburiside Ⅲ/Ⅳ。环氧醚式环烯醚萜型化合物是各种植物中广泛存在的环烯醚萜类化合物类型，其母核中的C6-7或C7-8间会涵盖环氧醚结构（β 型）。C4位或C7-8为环氧醚结构时，无任何取代基，C6位上与β 型羟基相连，并时常与糖类组成苷键，其他基团经常会取代糖基上羟基氢。

1.2 裂环环烯醚萜苷类

裂环式环烯醚萜型化合物形成与环烯醚萜环戊烷C7-C8共价键发生断裂现象有关，分子C8-C9以双键形式存在。通常C7位为酯基时，C10位经常为羟基。与此同时，C7位羟基与C11位羟基组建为环状内酯结构六元环。近年来，科研人员发现裂环环烯醚萜存在于多种植物中，如忍冬科金银花药用植物则涵盖较多的裂环环烯醚萜。在金银花水提取物中顺利分离出近7 种裂环环烯醚萜苷类化合物。女贞子药用植物具有滋补肝肾、明目、乌发等功效，该植物水溶性化学成分中重要活性成分之一则为裂环环烯醚萜类化合物。选取女贞子作为研究对象，从其70%乙醇提取物中通过分类获取新型裂环环烯醚萜类化合物，经鉴定得知，该新型裂环环烯醚萜类化合物为6′-O-肉桂酰基-8-表-金吉苷酸。

1.3 环烯醚萜乙缩醛酯类

环烯醚萜苷十分容易水解，会形成半缩醛结构苷元，其化学性质相对活泼且较易聚合，结晶苷元获取难度大。相关研究指出，蜘蛛香是一种含环烯醚萜类成分较高的败酱科缬草属蜘蛛香，涵盖单烯型环烯醚萜与双烯型环烯醚萜成分，缬草中的缬草环状结构发挥重要作用。与此同时，缬草醚酯为没有糖结构的单萜环烯醚萜成分，受热不稳定，尤其在碱性和酸性条件下会出现降解。国外科研人员早在1966 年提取缬草植物并从中顺利分离出环烯醚萜化合物，该物质也称为缬草三酯。

在研究中，从蚂蚁分泌腺中顺利分离出环烯醚萜，然而众多研究证实，此类化合物多存在于植物中，如龙胆科、山茱萸科、唇形科、马鞭科、木樨科、茜草科、玄参科等，其生物活性相对广泛。例如茜草科巴戟天中涵盖的水晶兰苷的抗炎镇痛作用相对显著，与巴戟天祛风湿作用有着紧密联系；山茱萸科中的山茱萸环烯醚萜有利于防治因糖尿病引发的肾功能结构改变、心脏病变以及血管并发症等多种并发症。此外，獐牙菜与龙胆科龙胆属重要成分为环烯醚萜，具有镇静镇痛、抗胆碱及保肝等作用，已开发至护胃药与抗肝炎药物。环烯醚萜是玄参科胡黄连属植物中不可缺少的化学成分，存在于胡黄中环烯醚萜类成分约有20 种。胡黄连苷-Ⅰ/Ⅱ为胡黄连环烯醚萜苷类成分关键活性物质，经研究发现，玄参中涵盖的桃叶珊瑚甙具有抗病毒、降血糖、抑制肿瘤生长、抗炎止痛及降血压等作用。

2 环烯醚萜类成分生物合成途径

经实验得知，萜类化合物合成分为IPP 与DMAPP生成的中间体生成、催化IPP 与DMAPP 生成各种类型中间体或萜类的萜类化合物合成、修饰复杂萜类终产物结构的后期修饰期三大阶段[4]。环烯醚萜属于相对特殊单萜类成分，其合成途径与上述3 大阶段较为相似。

2.1 中间体生成

研究领域共同认证的环烯醚萜中间体共有以下两条生成途径：（1）甲羟戊酸途径。细胞质负责该途径，即3 分子乙酰与酶A 相互作用缩合为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 并由此作为开端，参与其中的酶共有6个。（2）甲基-D-赤藓醇-4-磷酸途径。质体负责该途径，丙酮酸与由甘油醛-3-磷酸的相互缩合为开端，共有8 个酶发挥作用。此条途径也有6 个酶参与成功结晶并鉴定其结构。上述两个途径最后均合成IPP 及其异构体体二甲基丙烯基焦磷DMAPP。与此同时，该两条途径位于细胞不同位置且具有完全不同的起始物，然而二者却有相同产物，且存在DMAPP 与IPP 交互在质体与胞质中交互使用现象。相关研究者指出，经甲基-D-赤藓醇-4-磷酸途径合成的DMAPP 与IPP 参与四萜、双萜及单萜等生物合成。虽然自然界中萜类化合物有众多种类且结构多元，但其基本单位均为异戊二烯，DMAPP 或IPP 是其共同前体。

2.2 环烯醚萜骨架构成

经研究发现，香叶基焦磷酸（GPP）的形成与DMAPP 与IPP 有关，此两种物质通过香叶基焦磷酸酶进行催化并顺利催化为GPP。GPP 是不同萜类重要分解分界点，各种萜类通过GPP 沿不同代谢方向传递至生物碱、单萜、二/三萜等合成途径。GPP 在环烯醚萜合成中会先筛去磷酸基团，提炼出香叶醇。之后在香叶醇-10-羟化酶作用下，在C10位置上进行羟基化后再顺利生成10-羟基-香叶醇。紧接着CI 与C10位置通过氧化成为10-氧香叶醛，上述一系列均为链式反应。10-氧香叶醛需要通过环化这一重要步骤成为环烯醚萜的骨架琉蚁二醛，直至2012 年才发现作用于此步骤的环烯醚萜合酶。

2.3 后修饰阶段

相关研究表明[5]，环烯醚萜类物质以不同特征和形式存在于众多植物内，出现此现象的原因是修饰酶参与萜类生物合成过程。如酰基化、羟基化、糖基化、环氧化等修饰结构与小分子结合后修饰多种反应。环烯醚萜类化合物基本骨架组成为裂环环烯醚萜以及开裂环戊烷环烯醚萜。以下两种途径是环烯醚萜类成分组成：其一，从伊蚁二醛经去氧番木鳖酸和马钱素（番木鳖苷），由此生成裂环环烯醚萜以及复杂吲哚生物碱；例如龙胆与獐牙菜苦苷是獐牙菜、龙胆科龙胆等植物不可缺少的组成部分，裂环烯醚萜类合成是长春花等多种类型吲哚生物碱产生途径。獐牙菜/龙胆苦苷、吲哚生物碱物质重要中间体为裂环番木鳖苷。与环烯醚萜相比，裂环环烯醚萜具有深入且相对广泛的生物合成途径。与长春花吲哚生物碱生物合成途径有关研究已长达40 年，在研究中获得较多合成途径。因此，研究裂环番木鳖苷等不同形成生物合成途径有利于解析其他植物裂环环烯醚萜生物合成途径。

3 环烯醚萜类成分关键酶

3.1 IS 基因环烯醚萜合酶

环烯醚萜生物合成的关键酶之一为IS，即环烯醚萜合酶，该酶列属于孕酮5β-还原酶（P5βR）之中，更是超联脱氢酶/还原酶超基因家族重要组成。线性单萜10-Ioxogerania 是IS 基因环烯醚萜合酶底物，在长春花中发现该酶并对其鉴定。该酶不同于底物为香叶二磷酸并生成为阳离子中间产物单萜环化酶，单萜因全新的环烯醚萜苷合成酶在两个重要程序中得以环化，前驱10-氧香叶醛中的烯醇中间体从经典还原反应获得，此物质的环化效果基本从Diels-Alder 环加成反应产生。在深入研究和反复试验中发现环烯醚萜合酶，在试验中运用生物技术利用环烯醚萜酶顺利合成环烯醚萜类化合物，为此物质赋予生物活性，更具备相关功能。解析环烯醚萜合酶及其复合体结构时，也深入研究IS 催化机理，获得顺式与反式催化机制。此外，选取长春花作为研究物质，采取纯化、克隆、表达、结晶等方式，深入分析环烯醚萜合酶载酯蛋白与NADP+/8-oxogeranial 二者结合后的结构，发现活性中心中并未存在SDR 中传统的结构保守区Tyr/Lys/Ser。其中Tyrl78 涵盖有利于研究的催化功能且IS 底物相对专一，上述研究从不同层面揭示IS 催化机制。

3.2 SLS 基因

1993 年，Vetter等[6]发现SLS 基因，该基因对番木鳖苷环戊烯环氧化裂解发挥催化作用，使其分裂为开联番木鳖苷（RG）。该物质为细胞色素P450 重要组成。通过喂饲实验得知，液泡中会产生该反应，在长春花悬浮细胞中进行分离并分析其功能发现，该物质为细胞膜有关的且依赖于NADPH 与氧气的细胞色素P450 单加氧酶。SLS 基因在此过程中发挥催化作用，并由此合成开联番木鳖苷的酶。长春花（）是夹竹桃科（Apocynaceae）长春花属植物，目前，人们从长春花全草中分离了100 多种萜类吲哚生物碱（Terpenoid indolealkaloids，TIAs）。多数TIAs 由于具有生物学活性在现代医药得到广泛应用，例如抗肿瘤药物长春碱和长春新碱可用于治疗何杰金氏病、恶性淋巴肿瘤、急性淋巴细胞型白血病、绒毛上皮细胞癌及其他癌症，其硫酸盐已广泛用于临床，是目前应用最广的天然植物抗肿瘤药物NADPH 与分子氧是SLS 在反应中作用支撑，细胞色素P450 抑制剂与一氧化碳会阻断反应，说明细胞色素P450 调节该反应。通过原位杂交试验与免疫组织化学可知，长春花叶片的表皮细胞中存在SLS，但仅能从喜树、长春花、滇龙胆中顺利克隆到SLS 基因。其中喜树中SLS 基因组成编码为524 个氨基酸、1575bp 相对完整的开放阅读框以及cDNA 长度1706P。

3.3 G10H 基因香叶醇

经研究发现，环烯醚萜类化合物生物合成中关键因子为G10H 基因香叶醇，其中番木鳖苷生成首个环节都体现该反应。在裂环番木鳖苷生成中，G10H 所发挥作用为调控，故而G10H 基因香叶醇为烯醚萜类合成物第一次限速程序。同时，G10H 来自通过膜结合途径且高度依赖NADPH 细胞素P450 单加氧酶范围中的CYP768 成员。同时，G10H 自身涵盖能力相对薄弱，通过对3-羟基柚皮素进行催化，最后生成圣草酚活性。所以部分药用植物黄酮类合成中有G10H 基因香叶醇参与其中。从长春花中首次提炼和纯化出G10H 基因，一般植物体中涵盖不同类型的P450 基因，所以难以克隆出G10H 基因。2001 年首次从长春花中克隆出第1 个基因cDNA。目前，分别从川西獐牙菜、长春花、黑紫獐牙菜、秦艽等植物中克隆出G10H 酶编码基因，由此说明，川西獐牙菜中的獐牙菜苦苷与长春花中的碱等物质合成中G1OH 发挥调节作用。G10H 基因的开放阅读框为1488-1491，cDAN 全长1578-1637bp，其编码为495-496 个氨基酸。相关研究得出，存在于不同植物中的G10H 无跨膜及其部分跨膜结构域的表达量各有不同。如在川西獐牙菜中研究胚性细胞愈伤组织表达，从中得知，G10H 对裂环烯醚萜发挥上调作用。如在秦艽植物中，G10H 基因主要在其花与根中有所表达，在秦艽茎与叶中总表达量则相对偏低。

4 结语

大量研究表明，环烯醚萜类构效关系相对复杂，药理活性多，广泛存储于自然界中，提取工艺相对简单，可经化学合成方式获取该原料。通过研究环烯醚萜类成分生物合成途径及关键酶基因，可为借助基因工程方式体外改造酶及筛选获取高质高效生产环烯醚萜类工程奠定基础。当前相关领域仅从喜树、长春花、獐牙菜等少数植物中深入研究涵盖的环烯醚萜类生物合成，其相关功能基因研究也受到广泛重视，然而研究深入性不足，需结合转录组学与基因组学深入研究上述关键酶基因克隆、功能、次生代谢途径调控与影响，才能更好地推断环烯醚萜类主要活性与作用特征，为临床新药开发奠定基础。