新型饲用蛋白酶对肉鸡生产性能和消化功能的影响

2022-11-17张运锋李丹蕾占秀安

中国畜牧杂志 2022年11期

张运锋，李丹蕾，占秀安,*

（1.海南浙江大学研究院，海南三亚 572000；2.浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058）

近几年来，蛋白和能量饲料资源短缺的形势日趋加剧，导致大宗原料价格普遍大幅上涨，制约了养殖业的可持续发展。酶制剂作为一种绿色环保型饲料添加剂产品备受饲料企业的关注。蛋白酶作为催化水解各种蛋白质和多肽的一类酶，能将饲料蛋白质降解为蛋白胨、肽和氨基酸，该酶也广泛存在于动物消化道及体细胞溶酶中，与动物生命活动密切相关[1]。饲用蛋白酶可补充动物内源酶的不足，降解饲料抗营养因子，提高氮的利用率，减少氮的排放，有益于动物肠道发育、提高生产性能等[2-5]。目前，市场上饲用蛋白酶按其适宜的pH 主要分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶3 大类。由于不同种类蛋白酶理化性质的差异，以及试验动物、饲料加工温度等条件不同，饲用蛋白酶在养殖动物上的作用效果也不尽相同。新型蛋白酶作为一种既耐高温又耐酸的碱性蛋白酶（适宜pH=7～10），其在家禽方面的作用效果未知。本试验旨在探讨新型饲用蛋白酶制剂对肉鸡生产性能和消化功能的影响，为其生产应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料新型饲用蛋白酶（75 000 U/g 活性单位）由帝斯曼（上海）有限公司提供。1 U 定义为在pH 9.0和37℃条件下，每分钟从1 mmol/L 底物（Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA）中释放1 μmol 对硝基苯胺所需的酶量。

1.2 试验设计和饲养管理选取健康的1 d 岭南黄商品代肉雏鸡900 只，随机分为对照组、蛋白酶组和低蛋白+酶组，每组6 个重复，每重复50 只，公母各半。对照组和蛋白酶组饲喂基础日粮，对照组日粮不添加蛋白酶，蛋白酶组和低蛋白+酶组分别添加蛋白酶200 mg/kg。基础日粮参照《黄羽肉鸡营养需要量》（NY/T 3645-2020）配制，低蛋白+酶组饲喂粗蛋白质（CP）和能量水平偏低的日粮，根据帝斯曼公司实践经验提供的蛋白酶对饲料营养的贡献值适量降低日粮营养水平而设计，基础日粮和低蛋白日粮的原料组成及营养成分见表1。试验分为前期（1～21 d）和后期（22～52 d），共52 d。试验肉鸡地面平养，24 h 连续光照，自由饮食和饮水，常规饲养管理和免疫计划。

表1 基础日粮组成及营养成分（风干基础）

1.3 样品采集与指标测定

1.3.1 生产性能试验第1 天将肉雏鸡随机分配到各组各重复，以重复为单位进行全群称重，计算平均重即为初始重，分别在第21、52 天禁食12 h 后进行空腹称重，统计饲料消耗量，计算1～21、21～52、1～52 d 平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和耗料增重比（F/G）。

1.3.2 饲料CP 表观代谢率饲养试验后期，采用全收粪法进行代谢试验。每重复选4 只体重中等的健康公鸡于代谢笼，预试3 d，正试4 d，共7 d。正试期间，每日记录采食量和全部粪量。取部分鲜粪，加入10% 盐酸（以10 g 鲜粪加1 mL10%盐酸计量），带回实验室置于-20℃冰箱保存。将粪便解冻、混匀、烘干、回潮、粉碎过40 目筛，制成风干样品。饲料样和粪样参照《饲料中粗蛋白的凯氏定氮法》（GB/T6432-2018）测定含氮量，并计算饲料CP 表观代谢率。

1.3.3 血清游离氨基酸和氮代谢相关指标 52 d 禁食12 h后，从每个重复中随机选取2 只体重中等的公鸡，共60 只，翅静脉采血于真空促凝管中，待血清析出后，3 500 r/min 离心10 min，分离血清于2 mL 离心管中，带回实验室置于-80℃冰箱保存。取血清1.0 mL，加入7.5%三氯乙酸2.5 mL，震荡混匀，4℃12 000 r/min离心20 min，取上清，于全自动氨基酸分析仪（HitachiL-8900）上测定血清游离氨基酸浓度，进样量为20 µL，脯氨酸检测波长为440 min，其他氨基酸检测波长为750 nm。血清氮代谢相关指标尿酸（UA）、尿素氮（UN）和血氨（BA）浓度采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定。

1.3.4 粪便和空肠食糜相对黏度代谢试验期间，每重复取鲜粪80 g，加入500 mL 蒸馏水溶解混匀，采用NDJ-5SE 数显黏度计测定粪便黏度。肉鸡采血后屠宰，取空肠中段食糜2.0 g，采用HCl-KCl（0.2 mol/L，pH=1.5）缓冲液18 mL 稀释混匀，然后10 000 r/min离心15 min，取上清，采用毛细管黏度计测定食糜黏度。

1.3.5 十二指肠消化酶活性 1.3.3 采血后的肉鸡进行屠宰，取十二指肠中段2 cm 左右，液氮冻存。在实验室将十二指肠剖开后，用4℃生理盐水冲洗干净。然后，刮取肠黏膜0.1 g 于试管中，加入生理盐水0.9 mL，冰浴中充分匀浆后，3 000 r/min 离心10 min，取上清液，采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定胰蛋白酶和淀粉酶活性。

1.3.6 十二指肠形态结构 1.3.3 采血后的肉鸡屠宰，取十二指肠近中段2 cm 左右，用生理盐水冲洗食糜后，置于4%甲醛溶液中固定。采用乙醇梯度对甲醛固定的十二指肠进行脱水处理，石蜡包埋、连续横断切片（5～8 μm）和HE 染色处理后，使用Motic Images 图像分析系统，观察测定十二指肠上皮绒毛高度和隐窝深度，分别计算其平均值及绒隐比（V/C）。

1.4 统计分析试验数据先使用Excel 作初步处理，再利用SPSS 20.0 软件进行One-Way ANOVA 方差分析，采用Duncan's 法进行数据显著性检验分析，显著性水平为P＜0.05，试验数据使用平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 日粮添加蛋白酶对肉鸡生产性能的影响由表2 可见，蛋白酶组全期和后期的F/G 低于对照组（P＜0.05），低蛋白+酶组前期ADFI 高于对照组、蛋白酶组（P＜0.05），而其他指标组间均无显著性差异。

表2 日粮添加蛋白酶对肉鸡生产性能的影响

2.2 日粮添加蛋白酶对CP 表观代谢率的影响如图1 所示，低蛋白+酶组CP 表观代谢率高于对照组（P＜0.05），蛋白酶组与对照组无显著性差异，但一定程度上升高了CP 表观代谢率（0.05＜P＜0.1)。

图1 日粮添加蛋白酶对CP 表观代谢率的影响

2.3 日粮添加蛋白酶对血清游离氨基酸浓度的影响由表3 可知，蛋白酶组血清游离赖氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸和缬氨酸浓度高于对照组（P＜0.05），蛋氨酸和异亮氨酸浓度也高于低蛋白+酶组（P＜0.05），而低蛋白+酶组与对照组间各指标皆未有显著性差异。

表3 日粮添加蛋白酶对血清游离氨基酸浓度的影响 μg/mL

2.4 日粮添加蛋白酶对血清氮代谢相关指标的影响由表4 可见，2 个试验组血清UA、UN 和BA 浓度均低于对照组（P＜0.05）。

表4 日粮添加蛋白酶对血清氮代谢相关指标的影响

2.5 日粮添加蛋白酶对空肠食糜和粪便黏度的影响由表5 可知，2 个试验组空肠食糜黏度和粪便黏度均低于对照组（P＜0.05）。

表5 日粮添加蛋白酶对空肠食糜和粪便黏度的影响

2.6 日粮添加蛋白酶对十二指肠消化酶活性的影响由表6 可见，与对照组相比，低蛋白+酶组十二指肠黏膜的胰蛋白酶和淀粉酶活力、蛋白酶组淀粉酶活力均提高（P＜0.05），但蛋白酶组和低蛋白+酶组间各指标差异均不显著。

表6 日粮添加蛋白酶对十二指肠消化酶活性的影响 U/mgprot

2.7 日粮添加蛋白酶对十二指肠形态结构的影响由表7 可知，与对照组比，2 个试验组皆增高了十二指肠上皮的绒毛高度（P＜0.05）、降低了隐窝深度（P＜0.05），进而提高了V/C 值（P＜0.05）。

表7 日粮添加蛋白酶对十二指肠形态结构的影响

3 讨论

3.1 日粮添加蛋白酶对肉鸡生产性能的影响日粮添加蛋白酶能提高靶向动物营养物质（尤其是蛋白质）的利用率，尤其是在日粮蛋白水平相对偏低时，外源添加蛋白酶可起到弥补作用，从而有效减轻低蛋白日粮对肉鸡生长造成的负面影响[6]。本试验发现，在基础日粮中添加蛋白酶可显著降低肉鸡生长后期和全期的F/G，而对ADFI 和ADG 则无显著影响。李东东等[7]研究也发现，300 mg/kg 蛋白酶显著降低了肉鸡的后期F/G，但ADG和ADFI 无显著变化；但Walk 等[8]报道，添加从枯草杆菌中提取的蛋白酶对肉鸡F/G 则无明显影响。结果差异可能是因为所用的蛋白酶种类及其理化特性不同导致对内源消化酶分泌刺激以及协同作用也有所不同。张静静等[9]报道，在CP 水平降低2% 的日粮中添加500 mg/kg 蛋白酶能有效改善肉仔鸡的生长性能，并达到正常蛋白水平日粮的增重效果。周梁等[10]研究指出，低蛋白日粮中添加0.02%蛋白酶显著提高了7～21 日龄肉仔鸡的ADFI，但是F/G 没有显著变化。在本试验中，低蛋白+酶组提高了肉鸡生长前期ADFI，可能是由于前期幼鸡体内消化酶不足，但所需的蛋白水平高，因此幼鸡倾向于消耗更多的低蛋白日粮来维持自身生长[11]；同时肉鸡生长后期和全期ADG 和F/G 均达到了正常日粮对照组的水平，可能是因为蛋白酶提高了日粮蛋白质的消化吸收及氨基酸利用率，从而有效弥补了低蛋白日粮对肉鸡产生的负面影响。

3.2 日粮添加蛋白酶对蛋白质消化吸收和利用的影响蛋白酶可提高饲料CP 的消化吸收及利用率，因此适度降低日粮CP 水平并添加蛋白酶在维护生产性能的前提下能有效降低成本，获得更大的经济收益。本研究结果表明，在正常日粮或低蛋白日粮中添加蛋白酶均能有效提高饲料CP 的表观代谢率。奚刚等[12]和Vieira 等[13]分别在正常日粮和低蛋白日粮中添加蛋白酶，结果表明蛋白酶均显著提高了试验组鸡对CP 的表观代谢率。可能原因是外源蛋白酶与内源蛋白酶的作用位点等方面可能存在差异，外源蛋白酶能将一些内源蛋白酶难以消化的蛋白质水解为肽和氨基酸，进而提高了肉鸡对饲料蛋白的消化率[14]。

血清游离氨基酸主要来自于肠道对饲料蛋白质的消化吸收，可在一定程度上反映动物机体氨基酸的代谢水平，血清中总游离氨基酸含量越高，表明氨基酸的代谢效果越好[15]。在本研究中，正常日粮添加蛋白酶显著提高了血清赖氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸和缬氨酸浓度，低蛋白日粮添加蛋白酶使血清游离氨基酸浓度达到了正常日粮对照组的水平。由此说明，添加蛋白酶能有效提高肉鸡日粮蛋白质的消化吸收率。

血清UA、UN 等是反映畜禽体内氮代谢的重要指标，其含量主要受饲料蛋白质的消化吸收及机体蛋白质的分解影响[16]。Hajati 等[17]和吕秋凤等[18]研究发现，血清中UA、UN 含量与蛋白质的利用率之间存在显著负相关，因此通过血清中UA、UN 含量可以来判断机体对蛋白质的利用情况。在本试验中，正常日粮或低蛋白日粮中添加蛋白酶皆降低了血清UA、UN 浓度，与吕毅等[16]的研究结果一致。可能原因是蛋白酶促进了肉鸡对饲料蛋白的消化吸收和利用，从而降低了血清中UA、UN 含量。此外，本研究还发现血清BA 含量也显著降低。BA 除了一部分由UA 转变而来，其主要来自于肠道未被消化的蛋白质和氨基酸，在肠道细菌的作用下分解为氨气，进入血液中形成BA[19]。因此，血清BA 水平越低，则表明日粮中的蛋白质利用率更高。这也进一步佐证了添加蛋白酶能有效提高肉鸡对日粮蛋白质及其氨基酸的利用率。

3.3 日粮添加蛋白酶对小肠食糜黏度和消化酶活力的影响机体的化学性消化过程的主要部位是小肠，因此小肠食糜理化特性的改变直接影响到消化酶的活性及其对日粮的消化和吸收效率[20]。家禽肠道内消化物黏性加大，会引起食物蠕动性变慢，其排空速度也随之减缓[21]。由于动物小肠食糜黏度与营养物质消化吸收有很强的关联性，可以把食糜黏度的变化作为衡量所用酶制剂效果的重要指标之一[22]，但是目前关于蛋白酶对畜禽食糜和粪便黏度研究甚少。在本试验中，正常日粮或低蛋白日粮中添加蛋白酶均降低了空肠食糜黏度和粪便相对黏度，可能原因是蛋白酶将小肠中的黏性蛋白大分子降解为多肽片段和氨基酸，消除了大分子蛋白多聚物特性，不再形成黏稠的胶状物。

饲料蛋白质、脂肪和碳水化合物需要在消化酶的作用下被分解为小肽、氨基酸、脂肪酸、糖等小分子物质才能被动物小肠吸收，因此提高营养物质的消化吸收可通过添加外源酶制剂来实现[23]。李宗锐[24]报道，日粮添加蛋白酶显著提高了肉鸡十二指肠胰蛋白酶活力。刘伟等[25]研究表明，在玉米-豆粕型日粮中添加复合酶制剂（含8 000 U/kg 蛋白酶）显著提高了黄羽肉鸡十二指肠中胰蛋白酶和淀粉酶活力。张静静等[26]研究指出，在低蛋白日粮中添加蛋白酶也提高了肉仔鸡十二指肠中胰蛋白酶和淀粉酶活力。在本试验中，正常日粮或低能低蛋白日粮添加蛋白酶均提高了十二指肠胰蛋白酶和淀粉酶活力，说明添加外源蛋白酶有效促进了小肠内源酶的分泌。这也是上述日粮蛋白消化吸收和氨基酸利用率升高的主要原因。

3.4 日粮添加蛋白酶对十二指肠肠道形态结构的影响小肠是营养物质的主要消化吸收部位，小肠结构与功能的完整性影响着营养物质的消化、吸收与转运，其中小肠绒毛高度和隐窝深度与其生理密切相关，也是衡量肠道功能的重要指标[27]。绒毛高度和隐窝深度直接反映肠道对营养物质消化吸收能力，而V/C 能综合反映肠道对营养物质的吸收效率，比值越高，吸收效率越高[28-29]。在本试验中，正常日粮或低蛋白日粮中添加蛋白酶提高了肉鸡十二指肠的绒毛高度，降低了隐窝深度，进而增加了V/C。其他相关研究结果也发现蛋白酶能显著改善肉鸡小肠肠绒毛形态结构[30-33]，与本研究结论一致。由此可见，日粮添加蛋白酶有效改善了小肠的形态结构，进而提高小肠对营养物质的消化吸收能力[34]。