分子标记技术在农作物种子检测中的应用

王玉杰 冷春旭 孙中义 王 珣 赵 曦 李晓娟 赵 伟 吴立成

（1 黑龙江省农业科学院生物技术研究所，哈尔滨 150028；2 黑龙江省作物与家畜分子育种重点实验室，哈尔滨 150028）

种子是现代农业发展的“芯片”，是国家粮食安全和农业高质量发展的“源头”。2020年中央经济工作会议将解决好种子和耕地问题作为年度经济工作重点任务，鉴定种子质量是保障农业安全生产的重要工作之一，而种子纯度和真实性是种子质量控制中最难解决的问题。种子的纯度和真实性鉴定本质上就是品种基因型的鉴定，DNA 分子标记技术通过比较不同个体基因组DNA 序列差异来鉴定品种。

DNA 分子标记多态性的产生是由于DNA 分子出现插入、缺失、倒位、异位、重排和置换等排列造成的核苷酸差异。与传统形态标记、生化标记相比，具有分布广、多态性高、准确性高、操作快速简便、不受外界环境影响等优点。目前分子标记技术已成为作物纯度和真实性鉴定应用最广泛的技术。

1 分子标记技术的发展历程

分子标记技术是以DNA 多态性为基础的一种遗传标记，为农作物种子质量分析提供了更为准确、可靠、方便、快捷的方法。分子标记的发展经历了从以Southern 杂交为基础的第1 代限制性片段长度多态性（RFLP，Restriction fragment length polymorphism）标记到以PCR 反应为基础的2 代随机扩增多态性（RAPD，Random amplified polymorphic DNA）、扩增片段长度多态性（AFLP，Amplified fragment length polymorphism）、简单重复序列（SSR，Simple sequence repeat）和以测序为基础的第3 代单核苷酸标记（SNP，Single nucleotide polymorphism）。

1.1 RFLP 技术RFLP 作为第1 代分子标记于1980年被Bostein 等[1]发现，其原理是限制性内切酶识别并切割基因组DNA，经PAGE 电泳后，应用特定探针进行Southern 杂交，最后通过放射自显影获得RFLP 图谱。RFLP 标记具有稳定性高和共线性强等优点，但是随着PCR 技术的诞生和发展，RFLP 逐渐被淘汰，目前已不再应用该技术。

1.2 RAPD 技术RAPD 技术是以PCR 为基础发展起来的第2 代分子标记技术，于1990年被Welsh等[2]发现，其原理是利用单一随机引物将基因组中存在的重复序列之间的片段进行PCR 扩增，产物经凝胶电泳及染色即可显示多态性。与第1 代RFLP标记相比具有通用性强、成本低和检测方便等优点，而RAPD的缺点是反应条件敏感，稳定性和重复性差，无法用于基因分型。

1.3 AFLP 技术AFLP 标记是在RFLP 和RAPD标记技术基础上发展起来的技术，于1993年被Zabeau 等[3]发明，其原理是利用限制性内切酶切割基因组DNA 后，酶切片段在T4 连接酶的作用下与特定的接头连接，最后进行预扩增和选择性扩增，产物经电泳及染色显示多态性。AFLP 标记综合了RFLP 和RAPD 两种标记技术的优点，具有样品需求少、稳定性高、可靠性好且多态性高等特点，缺点是试验费用高、对DNA的质量要求较高。

1.4 SSR 技术SSR 也称为微卫星序列，是以1～6 个碱基为基序，经过串联重组而组成的DNA 序列，广泛存在于植物基因组[4]。其原理是利用SSR 两侧的保守序列为模板，设计特异引物，当SSR 重复的次数不同或者不完全重复时，经PCR 扩增及电泳分离，即可获得该位点的多态性。SSR 标记的优点是多态性丰富，稳定性和重复性好，且为共显性标记，可用于基因分型，缺点是开发成本高、费时费力。

1.5 SNP 技术SNP 是在SSR 标记基础上发展的第3代分子标记，于1996年由Eric S.Lander等发明，SNP 是指不同生物个体DNA 序列中单碱基差异，包括单个碱基的插入、缺失、转换和颠换等类型[5]。其原理是利用特异性的引物对某一基因进行PCR 扩增，检测SNP 位点信息，进行基因分型。SNP 分子标记技术具有遗传稳定性高、分布均匀、数量多、通量高、检测快和可实现自动化等优点，缺点是易出现假阳性、成本高，且必须在全基因测序的基础上进行分析。

2 分子标记在农作物种子检测中的应用

分子标记技术直接以种子DNA 作为研究对象，弥补和克服了传统农作物种子鉴定方法的不足，具有不受环境条件影响、操作简便快捷、数据稳定可靠等优点。近年来，在农作物种子质量检测中越来越受到重视。RFLP 标记因为DNA 用量大，技术复杂且检测过程中需要放射性同位素不便操作，所以不适合快速检测种子纯度和品种的真实性；RAPD 标记由于引物筛选工作量大，多态性不足，对品种的鉴定难度大，导致该标记很少应用到大规模的种子鉴定中；AFLP 标记兼具PCR的高效性与RFLP的可靠性，多态性强，可分析较大基因组作物，非常适合鉴定作物品种的真实性和纯度，但是操作程序复杂，需要很高的实验技能和精密的仪器，因此很难在作物种子质量鉴定中普及推广；SSR 标记既有RFLP的遗传学优点，又比RAPD的可信度高，还比AFLP标记操作简单、稳定性好，已成为可高效准确检测种子纯度和真实性的热点技术。2014年我国颁布了水稻、玉米、大豆3 个作物的品种鉴定技术规程-SSR 分子标记法的农业行业标准。SNP 标记具有重复性好、覆盖面广、遗传稳定性强等优点，特别适合亲缘关系较近和遗传背景复杂的品种鉴定，尤其适合大量样本检测，在种子质量检测中越来越受到重视，拥有广阔的应用前景。

2.1 分子标记应用于种子真实性检测种子的真实性是指一批种子所属品种、种或属与该品种审定时所描述的内容是否一致，是衡量种子质量的指标之一。品种真实性鉴定包括真实性验证和真实身份鉴定，真实性验证是把待测样品与对应的标准样品比较，检验两者是否相同；真实性身份鉴定是将待测样品与DNA 指纹数据库比对，确定样品的品种名称。传统鉴定种子真实性的方法主要是田间种植鉴定和蛋白质电泳等，而分子标记以DNA 多态性为基础，比传统鉴定方法更加快速高效，已广泛应用于种子真实性检测。

李雪等[6]利用40 对SSR 引物和3072 个SNP位点对11 套玉米杂交种和亲本进行鉴定，结果表明SSR 和SNP 在种子真实性鉴定方面具有较好的一致性；陈广凤等[7]利用SNP 分子标记对205 份小麦进行基因分型，结果表明SNP 标记在检测种子真实性、位点稳定性、品种区分能力以及遗传关系分析等方面准确可靠、快捷有效。进行真实性身份鉴定须建立DNA 指纹数据库，2010年农业部启动玉米、水稻、小麦、棉花、大豆等主要农作物标准样品的征集工作，为标准样品DNA 指纹库的构建提供了可靠的样品[4]。王凤格等[8]利用40 对SSR 核心引物对3998 份玉米审定品种标准样品构建了DNA 指纹图库，建立了玉米品种标准指纹比对服务平台。

2.2 分子标记技术应用于种子纯度检测种子纯度是衡量种子质量的另一个重要指标，也是影响作物品质和产量的关键因素。据统计，玉米种子纯度合格率每下降1%，产量下降3%[9]。种子纯度鉴定包括田间鉴定法、生化标记法以及DNA 分子标记法，其中分子标记法因其具有准确性高、稳定性好和重复性强等优点而广泛应用于作物自交系和杂交种纯度鉴定。

Smith 等[10]利用RFLP 鉴定了78 个玉米杂交种的纯度，Shimornura 等[11]研究发现2 对SSR 引物可区分10 个日本主栽草莓品种，Tommasini 等[12]利用3 组SSR 引物区分10 个油菜品种。吴明生等[13]发现1 个SNP 多态性位点可将2 个杂交玉米品种中混杂的亲本区分出来，匡猛等[14]从63K的棉花全基因组芯片中应用KASP 技术选出26 个杂合率高且分型效果理想的SNP 核心位点，进行棉花杂交种纯度检测。研究表明，SNP 检测种子纯度灵敏度更高，能将亲缘关系较近和遗传关系复杂的品种明确区分出来，特别适用大量样品检测。

3 展望

分子标记技术与传统检测方法相比具有快速、准确，不受环境影响等优点，目前已广泛应用于作物种子检测，大大提高了鉴定的效率，有效保障了种子的真实性和纯度，为实现农业安全生产，促进种业市场规范发展，推动农民增收贡献了力量。随着分子标记技术的发展，更多高效的新型分子标记将逐步被挖掘，种子检测体系也将不断地完善和成熟，为打击非法套牌及制售假劣种子提供了科技支撑，保障了我国的粮食安全。