植物抗病毒基因及其介导的抗性机理

郭子坤，刘瀚铮，李继平

(1.甘肃农业大学 植物保护学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省农业科学院 植物保护研究所，甘肃 兰州 730070)

目前，病毒病害在农业生产上造成的危害和损失越来越严重。仅以马铃薯为例，PVX和PVY两种病毒引起的产量损失分别达到10%和80%。由于病毒在植物细胞内寄生，所以对其防治非常困难，尚未找到理想的防治药剂，传统的杂交育种对此问题亦无良策。然而随着分子生物学研究的不断深化和基因工程技术的进一步完善，转基因技术在培育作物抗病毒新品种方面暂露头角。该项技术能否取得成功并走向成熟的关键就是植物抗病毒基因的获取及其作用机理的研究，经过30余年的努力，这一领域成果颇丰，并将不断取得新的进展。

1源自病毒的抗病毒基因

1.1 外壳蛋白基因

对于病毒病而言，由外壳蛋白基因介导的植物抗性首次报道于1986年，当年Powel等[1]在烟草中导入TMV基因，结果获得抗TMV的转基因植株。以后有学者把含有黑麦草花叶病毒(RGMV)外壳蛋白基因的CPTAG结构导入黑麦草，试验证明，多数转入外壳蛋白基因的植株对病毒产生抗性[2]。L3是番茄斑萎病毒(TSWV)的一个保加利亚隔离株系，Stoeva等[3]观察了表达该株系核蛋白基因正义结构的12种商用烟草(Nicotianatabacum)栽培品种对TSWV的长期抗性，结果显示，不论转基因表达翻译的产物是否达到可检测的水平，也不论是在温室或大田条件下，抗性均能稳定遗传下去。Jacquet等[4]发现，含有经修饰和酶切的李子疱疹病毒外壳蛋白基因片段的转基因植株高抗李子疱疹病毒(PPV)；他们先对两个PPV外壳蛋白基因进行修饰和酶切，以减轻生物学上异源外壳化风险，再将这两种结构通过农杆菌导入Nicotianabenthamiana植株；在第一个结构中删除了蚜传PPV病毒所含有的编码DAG三联体氨基酸的9个核苷酸，在第二个结构中，PPV外壳蛋白基因首位420个核苷酸被去掉。Sherman等[5]将3种番茄斑萎病毒外壳蛋白基因结构通过土壤农杆菌的转化作用导入菊花(Dendranthemagrandigqoracv. Polaris)，这3种结构分别包含一个全长的外壳蛋白基因(PTSWVN+)；一个外壳蛋白基因，但编码截去顶端的外壳蛋白(PTSWVNt)；一个反义翻译的全长外壳蛋白基因(PTSWVN-)，所有这些均来自大丽花属分离物TSWV(TSWV-D)。 对 152PTSWVN+、37PTSWVNt和47PTSWVN-转导植株的插条进行初步抗性筛选，所用的高毒、异源TSWV毒株(TSWV-GB)分离自菊花或由蓟马(Frankliniellaoccidentalis)接种。通过筛选剔除大多数TSWV感病转基因株系。3轮机械接种抗性试验表明，一个PTSWVNt和两个PTSWVN-转导株系没有表现系统症状，也没有病毒量上的积累。6个其他株系(包括一些PTSWVN+株系)未表现一个或多个TSWV毁灭性坏死症状(茎溃疡和顶芽坏死)，而且在症状表现上出现延迟现象。可发现在菊花上不论正义和反义结构均可增强其对TSWV的抗性。分子分析显示，高抗TSWV的PTSWVNt株系没有可检测的外壳蛋白水平。所有3个抗性株系有低水平的外壳蛋白基因转录本，而且在它们的基因组中至少有3个转基因插入位点，尽管感病株系的插入位点与此相似。

近年来，国内学者在外壳蛋白基因介导的植物抗病性研究方面也做了大量工作。刘佳等[6]将番茄不孕病毒(TAV)和菊花B病毒(CVB)的外壳蛋白TAV-CP与CVB-CP基因的部分片段，拼接成CBT基因，构建植物表达载体，该项研究对今后培育抗病毒菊花品种意义重大。田莉莉等[7]为获得抗病毒的转基因植物新材料，采用PCR方法克隆获得489 bp的ASPV外壳蛋白基因的保守片段，得到Phe-ASPV，将其转入EHA105，得到植物遗传转化工程菌EH-ASPV。王建辉等[8]在pBI121 质粒 35S 启动子后插入具有发夹结构的葡萄病毒A(GVA)外壳蛋白基因片段后转化EHA105，农杆菌瞬时浸润本氏烟叶片 5 d 后发现，对照组植株表现黄化症状，而瞬时表达病毒外壳蛋白基因的处理组植株症状不明显。2020年有报道[9]称，得到表达CWMV CP基因的烟草Nicotianabenthamiana，导入的 CP 基因使烟草对CWMV 的抗性显著增强。

CP介导的抗性作用机理比较复杂，尚未有统一的模型可加以解释。目前主要有4种观点：①CP的表达抑制了病毒的脱壳。②由于转基因在细胞大量表达CP蛋白，病毒裸露核酸入侵后，被其迅速包裹，从而阻止了核酸的复制。③阻断病毒粒子的扩展与运转。④转入的CP基因在植物细胞表达mRNA，它们与病毒RNA相互作用，以此产生抗性。

1.2 病毒复制酶基因

在关于病毒复制酶介导的抗性研究中，有学者将PEBV(豌豆早褐病毒)复制酶核酸片段导入烟草，结果发现：在100 u g/mL的接种量下，成功转入复制酶基因的植株仍高度抵抗病毒[10]。目前，复制酶介导的保护作用已在10多个病毒属中得到研究[11]，涉及13种病毒。

对于病毒复制酶基因介导的抗性，多数学者接受的解释有两种：①认为转入的复制酶基因在植株体内的表达反向调控了病毒复制，使复制率明显降低；②认为象噬菌体Qβ那样，转入的复制酶基因在植株体内表达突变的复制酶，可能与复制酶的野生型发生竞争，打乱了病毒复制，因此使植物产生抗病毒能力[12]。

1.3 病毒运动蛋白基因

Tacke等[13]研究发现，表达黄矮病毒属的17 ku MP突变体马铃薯，不仅抵抗黄矮病毒的侵染，而且抵抗PVX和PVY的侵染。Cooper等[14]获得含有突变的TMV运动蛋白基因的转基因烟草植株，攻毒试验表明，转基因植株对烟草花叶病毒组等多个病毒组的病毒具有广谱抗性。另有学者得到表达P24蛋白的转基因烟草植株(NicotianatabacumXanti D8 NN)，P24蛋白是3个交结在一起的PVX局部运动蛋白之一。体内有最高水平P24蛋白积累的植株显示矮化和轻微褪绿表现型。这些转基因植株可使PVX突变体(该突变体在P24蛋白上产生一个移码突变)在细胞之间的移动更加容易。用TMV接种后，P24+植株上的局部坏死病斑显著小于未转化的对照植株；当用Ob病毒(Ob病毒能够躲避N基因引起的过敏性反应)接种后，已转化的植株在系统抗性方面表现明显，未观察到系统症状；而且Western免疫病斑分析和回接分析均表明，病毒的积累保持低水平或无法检测到病毒[15]。Cui等[16]在中国7个地区随机采集的166份(21.1 %)李样品中，检测到35份呈现PNRSV阳性，15个分离株的运动蛋白基因(MP)具有82.9%～99.9 %的核苷酸序列同源性，对MP基因序列采用系统发育分析，结果显示分离物PV96、PV32和PE5为3个明确的系统发育群，该结果对MP基因介导抗性的研究有参考价值。刘晓玲等[17]采用PVX为研究对象，将其运动蛋白基因(PVX-p25)转化烟草NC89，经筛选和PCR检测，共获得转非翻译PVX-p25的转基因植株78株，结果表明，其中的31株对PVX具有高度抗病，比例达到39.7%。

由于转入植物体内的MP基因所表达的MP蛋白不具备病毒MP蛋白的功能，但它们与野生型病毒MP具有竞争关系，竞相争夺位于胞间连丝上的结合位点，从而阻碍病毒粒子在宿主体内的转移与扩散。

2 与病毒基因相关的其他基因序列

2.1 病毒卫星RNA

卫星RNA是多核苷酸，它们往往存在于辅助病毒中，依据辅助病毒的复制与传播机理，从一个植株传到另一个植株，它们与作为其宿主的辅助病毒核苷酸异源，对病毒的复制也不起作用，但是卫星RNA可以改变其辅助病毒致病力。

卫星RNA最初由Kaper发现。Stommel等[18]把表达黄瓜花叶病毒的一个改良卫星RNA导入两种易感基因型，获得3株转基因番茄植株。对它们进行两个生长季节的观察，以评估其病毒症状、效价、卫星RNA的表达及果实产量。结果发现，转基因植株表现较轻或无CMV症状且效价较低(与未转化植株相比)。转基因植株上卫星RNA水平与病害严重程度之间存在明显负相关关系。CMV病毒感染的卫星转基因植株总的可销售产量比CMV感染的父母本植株提高40%～84%。尤其是，转基因植株产量与父母代植株无显著性差异。风险评估证明，在试验场所范围内卫星RNA传播水平较低且无对周围植物造成危害的证据。Taliansky等[19]选用花生丛病毒(GRV)弱毒卫星RNA的全长序列，将其导入本生烟，获得转基因植株，当GRV和强毒卫星RNA接种时，转基因植株未显症。顾沛雯等[20]的研究发现，利用CMV的卫星RNA生防制剂S52免疫辣椒，田间对比试验显示，免疫接种50 d的防效达71.2%～84.2%，免疫接种80 d的防效达55.9%～70.2%，由此可见，CMV卫星RNA作为抗病毒基因材料，在辣椒抗病毒转基因育种方面亦将大有作为。

卫星RNA介导的抗性机理尚未完全搞清。一般认为，可能由于竞争病毒RNA复制酶而诱发抗性。

2.2 正义与反义RNA

反义RNA和正义RNA均可介导植物的抗病性。Tavert等[21]曾设计了两种李树水痘病毒(PPV)的Pl基因结构，随后将这两种P1基因通过农杆菌导入Nicotianabenthamiana植株，当用PPV病毒接种时，转基因植株或免疫或恢复感染。生化分析结果表明，抗性表现型与转基因转录的水平相关联。Scharer等[22]把花椰菜花叶病毒(CaMV)35S RNA先导序列导入烟草而获得抗病毒的转基因植株；他们还研究了在转基因烟草植株体内35S RNA先导序列对下游 葡糖苷酸酶(GUS)报告基因表达的影响。Marano等[23]的研究发现，含有烟草花叶病毒Ul株系(TMV Ul)开放阅读框(ORF)基因的转基因植株可抵抗TMV-U1的入侵；但它们不抗十字花科植物的TMV病毒株系，然而这些转基因植株对含有54 ku开放阅读框(ORF)的PVX却产生抗性，无论该ORF是正向或反问嵌入。蔡群芳等[24]构建RNA正义、反义表达载体并导入农杆菌，获得相应的农杆菌工程菌株，对以后开展番木瓜抗PRSV育种工作奠定了基础。

RNA介导的抗性存在复杂的相互作用过程，反义RNA表现的抗性可能是因转基因RNA与病毒RNA直接相互作用所致，这种相互作用有不同的组织特异性RNA表达(Harnmond等，1995);正义RNA则通过交叉保护机制干扰病毒的复制，也有人认为正义RNA具有与原编码蛋白一致的ORF，但在植物体内的转录不能翻译出有功能的蛋白，从而达到抗病毒的目的。

2.3 缺陷干扰颗粒

缺陷干扰颗粒(Defective interfering particles，DIP)是不能自身进行复制的缺陷病毒，但具有干扰同种成熟病毒进入细胞的能力。DIP最早是由Huang于1970年提出，它存在于多种动物病毒和植物病毒中，是病毒的一种分子寄生物。尽管卫星RNA也属于分子寄生物，但二者与其宿主的来源不同，DIP与其宿主病毒核酸同源，可它在病毒核酸中有不连续体。DIP本身不能增殖，也不能产生干扰性病毒，但当DIP序列在转基因植株中表达时，其与接种病毒竞争复制，从而干扰接种病毒的复制。Imad等[25]发现，经黄网病毒缺陷干扰颗粒转化处理的Nicotianaedwardsonii，接种 SYNV(苦苣菜黄网病毒，SonchusYellow Net Virus)5个月后，用电镜检查烟株，在叶片和根细胞中均未观察到病毒粒子。Marsh等发现，用BMV的RNA2构建DIP，其在大麦原生质体内对病毒复制产生干扰。

DIP干扰病毒复制的机理为：①DIP对RNA聚合酶的亲和力大于正常病毒的亲和力，在核酸复制过程中，两者竞争导致正常病毒不能有效结合RNA聚合酶而使子代病毒产量下降；②由于DIP缺损了一段核酸，因此，在复制过程中，它比正常病毒更快，占用了大量的RNA聚合酶而干扰了正常病毒的复制；③阻碍病毒的包装、释放和入侵[26]。

2.4 核酶基因

1981年Cech和Alfman在研究四膜虫mRNA前体的剪接时，首次发现核酶。Kidmtop等[27]认为，核酶可与相应的特异序列RNA底物结合，具有切割功能。Natsoulis等于1991年提出可将CP和核酶连接构成融合蛋白，组装成病毒外壳，因它具有核酶活性，可在特定条件下特异降解病毒核酸，达到抗病毒的目的。Feyter等[28]则将核酶和反义基因相结合转化烟草，发现转基因植株对TMV抗性较高。Yang等[29]根据马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid)基因组的特定区域序列设计核酶基因，并将之导入马铃薯植株，结果表明转基因植株高抗马铃薯纺锤块茎类病毒。

在国内，刘力等[30]则设计合成了特异切割水稻条纹叶枯病毒RNA保守区及编码病害特异性蛋白(Disease specific protein，DSP)基因的核酶，两种核酶基因长度均为40个碱基，序列测定表明，克隆得到的核酶序列与设计的核酶序列完全一致，在体外均具有特异性切割活性，为培育在水稻体内切割病毒RNA分子的转基因抗病毒品种提供了思路。另外，还有孔卫青等[31]、张剑峰等[32]分别克隆对桑花叶萎缩类病毒及马铃薯卷叶病毒具切割能力的核酶基因，并获得转录载体，为通过基因工程手段培育桑树和马铃薯抗病毒品种做了有益的前瞻性探索。

3 源自植物的抗病毒基因

植物在长期与病毒相互斗争的过程中形成一套对付病毒等病原物侵染的防御机制，也就是说植物本身存在抗性基因，通过这些基因的表达，可产生某些特定的蛋白质以抗拒病毒入侵。虽然目前人们对植物抗病毒基因赋予植物抗性的机理了解较少，但将这些基因导入植物以获得抗病毒转基因植株无疑具有广阔前景。

3.1 潜在自杀基因

在植物潜在自杀基因方面，N基因的研究已有成效，有研究表明，含有N基因的烟草在接种TMV后能诱发过敏性坏死性反应(Whitham等，1994)。其他植物潜在自杀基因的研究鲜见报道。

潜在自杀基因本来就属于植物基因，只是它在正常情况下不引发植物细胞的死亡，比如在普通品种中表现隐形，在野生品种中表现显性，只有显性情况下一旦遭遇入侵病毒，发生互作时才引发宿主细胞凋亡，保护附近健康的植物细胞不被感染。

3.2 病程相关蛋白基因

当植物遭受病毒及病原物侵染后，植株便会产生一类病程相关蛋白(PR)，PR蛋白由植物自身编码。PR蛋白可分为5组，第1组与植物对病毒的抗性有关，如辣椒携带的ya(pr21)抗性基因对PVY和TEV具有有效的抗性，当辣椒植株受到侵染时，病毒在侵染细胞内增殖，不能产生系统性的扩散(Hinrichs等，1997)。植物转入病程相关蛋白基因后，其介导的抗性机理可能与转基因表达的PR蛋白参与植物细胞壁抗侵染有关，也可能与它们协调作用有关。

3.3 核糖体失活蛋白基因

核糖体失活蛋白(RIP)广泛存在于高等植物中，有两种类型：I型为单链碱性蛋白质，分子量约为30 ku，II型为由A、B两条肽链通过二硫键组成的二聚体，分子量约为60 ku。RIP主要具有RNA N-糖苷酸酶活性，有些RIP则以其核酸酶(RNase)活性起作用。美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)是一种RIP蛋白，从美洲商陆(Phytolaccaamericana)叶片中分离出得到，其分子量约30 ku，Lodge等[33]对转PAP基因植株进行攻毒试验，结果表明，转基因植株对多种病毒表现抗性。Krishnan等[34]对另一种核糖体失活蛋白基因(天花粉蛋白基因)的研究显示，表达天花粉蛋白前体基因的植株对CMV和TMV系统侵染症状具有迟滞作用，局部的枯斑数量亦减少。范琦等[35]克隆出新的玉米RIP基因，该基因序列长983 bp，其中编码区长828 bp，共编码275个氨基酸和一个终止密码子，GC含量为58.3%。林毅等[36]从传统中草药绞股蓝中分离出一种新型核糖体失活蛋白，该蛋白对烟草花叶病毒具有抗性；他们还得到13个核糖体失活蛋白基因序列，为培育抗病作物新品种提供了新的基因资源。

4 植物抗体基因

虽然植物缺乏动物那样的免疫系统，对病毒不能产生抗体，然而可将源自动物的中和病毒之抗体基因导入植物，使植物也能表达中和抗体，以抵抗病毒侵染。植物抗体基困可分为3个基本类型，即嵌合抗体基因、改形抗体基因和小分子抗体基因[37]；Tavladoraki等[38]的研究发现，将scFv抗体基因导入烟草后，细胞质表达scFv的转基因植株可抵抗菊芋斑纹病毒(AMCV)的侵染。刘德虎等[39～42]的试验证实，3个杂交瘤细胞系(D73、D90和A69)产生的单克隆抗体均能与PVYO、PVYN及PVYC发生亲和性反应，以D73为最强。侵染抑制试验表明，经D73单克隆抗体处理后的病毒接种物，其在Solanumdemissum×S．Tuberosum离体叶片引起枯斑的能力显著受到抑制。他们在此基础上构建了马铃薯Y病毒中和抗体基因文库，从基因文库中筛选轻链和重链基因阳性克隆，并分析了轻、重链基因的序列，构建了其植物表达载体。

5 干扰素基因

脊椎动物细胞在受到病毒感染后能合成并分泌干扰素，干扰素(Interferon)是一种具有高度生物活性的调节细胞功能的多功能蛋白，分子量较小，能结合在细胞质膜上，并导致抗病毒态的形成。最初发现于流感病毒，后从烟草、番茄、番椒、丁香等植物中也分离出干扰素(Fantes，1975)。国外有学者将大鼠体内编码干扰素之一的2'，5'-寡腺苷酸合成酶基因导入马铃薯植株，结果用PVX攻毒时，转基因植株叶与块茎中病毒浓度显著低于对照植株(未转化)[10]。中国学者已将人的-干扰素基因导入烟草和水稻中并得到表达，表达的干扰素具有抗病毒活性。宋莉等[43]对转干扰素基因ChIFN- 烟草植株进行TMV接种试验，结果证明转入的基因赋予阳性植株对TMV的抗性。

6 结语

植物抗病毒基因介导的抗病性为培育抗病品种并从根本上防治植物病毒病害开辟了一个全新的领域。自1986年Powell等获得首株转基因抗病毒植株以来，众多研究人员在该领域不断推进，成绩斐然，新的抗病毒基因资源不断被发现，转化的植物种类越来越多，转基因的遗传稳定性越来越高。然而，通过对这一领域研究工作的简略概括，不难发现仍有不足之处，因此，今后的研究工作应侧重以下几个方面：①植物抗病毒基因资源的分类与整理工作；②植物抗病毒基因介导的抗性分子基础；③抗病毒转基因在植物体内表达的影响因子(如转基因的重组、沉默等)；④新的抗病毒基因的发掘特别是源于植物自身的抗病毒基因的开发与利用；⑤在明确抗性机理后如何开展抗病毒基因的人工智能化设计与克隆；⑥抗病毒转基因的生态安全性与遗传稳定性。