山姜素对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的保护作用机制

陈颖妹 翟任群 周 菲（海南省人民医院，海南医学院附属海南医院心电图室，海口 570311）

缺血性心脏病是临床常见疾病，目前主要治疗手段为经皮冠状动脉介入治疗等，但在血管治疗过程中可能引起心肌缺血再灌注损伤。研究发现，心肌细胞炎症反应、氧化应激加剧可引起细胞凋亡进而加重心肌组织损伤，因此寻找减轻心肌缺血再灌注损伤的药物有助于提高再灌注治疗效果［1］。研究报道，中药含有多种有效成分且具有抗炎、抗氧化等作用，可用于多种心血管疾病临床治疗［2-3］。山姜素是从传统中药中提取的物质，具有抗菌、抗氧化、抗癌等作用，并可抑制炎症相关性疾病发生，研究表明，山姜素可抑制角叉菜诱导的急性炎症反应［4］。但山姜素对心肌缺血再灌注损伤的治疗效果鲜有报道。环状RNA（circular RNA，circRNA）是新型非编码RNA分子，可充当miRNA海绵分子调控细胞增殖、分化等生物学过程，研究表明，circPRKCI在脂多糖诱导的人肾小管上皮细胞中表达下调，上调其表达可减轻细胞损伤［5］。生物信息学预测显示，miR-29b-3p在缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）诱导的心肌细胞中表达上调，并可加重心肌细胞损伤［6］。但circPRKCI/miR-29b-3p轴是否参与心肌缺血再灌注损伤过程，以及circPRKCI是否可作为山姜素治疗缺血性心脏病的治疗靶点尚未阐明。因此，本研究采用H/R诱导大鼠心肌细胞H9C2建立心肌细胞损伤模型，探讨山姜素是否可通过调控circPRKCI/miR-29b-3p轴减轻心肌缺血再灌注损伤。

1 材料与方法

1.1 材料 山姜素购自美国Sigma；大鼠心肌细胞H9C2购自上海弘顺生物；DMEM培养基、MTT试剂、DMSO、凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝；RNA提取试剂盒、逆转录试剂与荧光定量PCR试剂购自美国Megentec；Lipofectamine2000购 自 美 国Invitrogen；miR-NC、miR-29b-3p mimics、si-NC、si-circPRKCI购自广州锐博生物；pcDNA、pcDNA-circPRKCI购自上海吉满生物；LDH、MDA、SOD、MPO、IL-1β、TNF-α检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；ATP检测试剂盒购自上海碧云天生物；兔抗鼠Bcl-2、Bax与二抗购自美国Abcam；Model 680酶标仪购自美国Bio-Rad；IX71荧光显微镜购自日本Olympus；Step-OnePlus实时荧光定量PCR仪购自美国ABI；FACS Calibur流式细胞仪购自美国Becton Dickinson。

1.2 方法

1.2.1 分组H9C2细胞接种于6孔板（1×105个/孔），将其置于37℃、95%N2、5%CO2培养箱内缺氧处理24 h，弃旧培养基后加入37℃、5%CO2培养箱复氧处理6 h，记为H/R组［7］，未经处理的H9C2细胞记为对照组。取对数生长期H9C2细胞分别培养于含不同浓度（5、10、20 mg/L）山姜素的培养液中［8］，各组细胞培养24 h后进行H/R处理，分别记为山姜素低、中、高剂量组。取对数生长期H9C2细胞接种于24孔板（2×104个/孔），分别转染pcDNA、pcDNA-circ-PRKCI 24 h后再进行H/R处理，记为H/R+pcDNA组、H/R+pcDNA-circPRKCI组。si-NC、si-circPRKCI分别转染H9C2细胞24 h后置于含20 mg/L山姜素的培养液中继续培养24 h后再进行H/R处理，记为山姜素高剂量+si-NC组、山姜素高剂量+si-circPRKCI组。

1.2.2 检测氧化应激指标LDH、MDA、SOD水平收集各组细胞培养上清，根据试剂盒说明书检测LDH含量。反复冻融法裂解各组H9C2细胞，根据试剂盒说明检测MDA、SOD水平。

1.2.3 ELISA检测炎症因子MPO、IL-1β、TNF-α水平收集各组H9C2细胞培养上清，ELISA检测MPO、IL-1β、TNF-α水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.4 MTT检测细胞增殖 收集各组H9C2细胞接种于96孔板（3×103个/孔），20µl/孔加入MTT溶液，继续培养4 h后弃上清，150µl/孔加入DMSO，室温避光振荡孵育5 min，酶标仪检测各孔吸光度，计算细胞存活率（%）=OD实验组/OD对照组×100%。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集各组H9C2细胞，预冷PBS洗涤，弃上清，收集细胞沉淀，加入500µl结合缓冲液悬浮细胞，分别加入5µl Annexin V-FITC与5µl PI，室温振荡孵育10 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6 化学发光法检测ATP含量 取各组H9C2细胞，裂解，4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清，化学发光法检测ATP含量，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.7 qRT-PCR检 测circPRKCI、miR-29b-3p表达 根据RNA提取试剂盒（miRNA提取试剂盒与普通RNA提取试剂盒）说明书分别提取H9C2细胞RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度，反转录体系：5×gDNA Buffer 2µl、10×King RT Buffer 2µl、Fast-King RT Enzyme Mix 1µl、FQ-RT Primer Mix 2µl、RNA 2µg，RNase-Free ddH2O补足至20µl；反应条件：42℃15 min，95℃3 min。以2µl cDNA进行qRT-PCR扩增，按照试剂盒说明书配制反应体系，反应程序：95℃预变性2 min（循环1次），95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循环。荧光定量PCR仪检测目的基因表达。circPRKCI正向引物：5'-ATTCAGGGACACCGTTCTT-3'，反向引物：5'-CTCTTCAGAACACTTGCAGCTT-3'；miR-29b-3p正向引物：5'-TGCGCTAGCACCATTTGAAAT-3'，反向引物：5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6正向引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'；GAPDH正向引物：5'-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'，反向引物：5'-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3'。

1.2.8 双荧光素酶报告基因检测circPRKCI与miR-29b-3p的靶向关系 采用点突变试剂盒突变circPRKCI与miR-29b-3p结合位点，分别构建含结合位点与突变位点的野生型载体WT-circPRKCI和突变型载体MUT-circPRKCI，采用脂质体转染技术分 别 将WT-circPRKCI、MUT-circPRKCI与miR-NC或miR-29b-3p mimics共转染至H9C2细胞，24 h后收集细胞并检测相对荧光素酶活性。

1.2.9 Western blot检测Bcl-2、Bax蛋白表达 采用蛋白裂解液提取H9C2细胞总蛋白，高温变性，取40µg蛋白样品进行10%SDS-PAGE电泳，分离蛋白凝胶，转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，分别于一抗稀释液（Bcl-2 1∶1 000、Bax 1∶1 000、GAPDH 1∶3 000）、二抗稀释液（1∶5 000）中孵育，孵育时间与条件分别为4℃24 h、37℃1 h，Image J软件分析各条带灰度值。

1.3 统计学处理 采用SPSS21.0软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 山姜素对H/R诱导的心肌细胞氧化应激及炎症因子的影响 与对照组比较，H/R组LDH、MDA、MPO、IL-1β、TNF-α水平升高（P＜0.05），SOD活性降低（P＜0.05）；与H/R组比较，山姜素低、中、高剂量组LDH、MDA、MPO、IL-1β、TNF-α水平降低（P＜0.05），SOD活性升高（P＜0.05），且呈剂量依赖性（表1）。

表1 山姜素对H/R诱导的心肌细胞氧化应激及炎症因子的影响（±s，n=9）Tab.1 Effect of alpinetin on oxidative stress and inflammatory factors in H/R-induced cardiomyocytes（±s，n=9）

表1 山姜素对H/R诱导的心肌细胞氧化应激及炎症因子的影响（±s，n=9）Tab.1 Effect of alpinetin on oxidative stress and inflammatory factors in H/R-induced cardiomyocytes（±s，n=9）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with H/R group，2）P＜0.05；compared with Alpinetin-L group，3）P＜0.05；compared with Alpinetin-M group，4）P＜0.05.

Groups Control H/R Alpinetin-L Alpinetin-M Alpinetin-H FP LDH/（U·L-1）124.76±15.34 326.47±32.401）234.35±18.992）183.69±7.282）3）156.09±5.852）3）4）161.657＜0.001 MDA/（nmol·ml-1）1.03±0.04 4.86±0.461）3.22±0.142）2.32±0.222）3）1.83±0.072）3）4）338.746＜0.001 SOD/（U·ml-1）40.83±4.36 12.40±1.151）16.41±0.982）20.50±1.022）3）26.45±2.342）3）4）198.774＜0.001 MPO/（U·g-1）21.82±2.10 90.69±3.241）68.30±3.322）50.26±5.992）3）37.09±3.682）3）4）430.794＜0.001 IL-1β/（pg·ml-1）16.91±1.28 85.83±4.241）68.65±2.422）51.92±4.702）3）34.48±3.972）3）4）525.691＜0.001 TNF-α/（pg·ml-1）12.20±1.68 120.11±8.141）79.75±6.312）60.20±5.552）3）40.46±4.302）3）4）472.045＜0.001

2.2 山姜素对H/R诱导的心肌细胞增殖、凋亡及ATP含量的影响 与对照组比较，H/R组细胞存活率和ATP含量降低（P＜0.05），凋亡率和Bax蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05）；与H/R组比较，山姜素低、中、高剂量组细胞存活率和ATP含量升高（P＜0.05），凋亡率和Bax蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平升高（P＜0.05），且呈剂量依赖性（图1、表2）。

表2 山姜素对H/R诱导的心肌细胞增殖、凋亡及ATP含量的影响（±s，n=9）Tab.2 Effect of alpinetin on proliferation，apoptosis and ATP content of cardiomyocytes induced by H/R（±s，n=9）

表2 山姜素对H/R诱导的心肌细胞增殖、凋亡及ATP含量的影响（±s，n=9）Tab.2 Effect of alpinetin on proliferation，apoptosis and ATP content of cardiomyocytes induced by H/R（±s，n=9）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with H/R group，2）P＜0.05；compared with Alpinetin-L group，3）P＜0.05；compared with Alpinetin-M group，4）P＜0.05.

Groups Control H/R Alpinetin-L Alpinetin-M Alpinetin-H F P Survival rate（%）100.10±2.59 28.99±3.341）46.13±4.222）61.19±2.722）3）74.86±4.162）3）4）551.327＜0.001 Apoptosis rate（%）5.93±0.58 29.17±3.371）19.27±0.872）16.66±0.432）3）13.60±0.482）3）4）251.360＜0.001 ATP/（nmol·mg-1·L-1）24.70±2.07 11.02±0.791）14.18±0.462）16.04±0.592）3）18.67±0.612）3）4）205.483＜0.001

图1 山姜素对H/R诱导的心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响Fig.1 Effect of alpinetin on H/R-induced cardiomyocyte apoptosis and Bcl-2 and Bax protein expressions

2.3 山姜素对H/R诱导的心肌细胞circPRKCI与miR-29b-3p表达的影响 与对照组比较，H/R组circPRKCI表达降低（P＜0.05），miR-29b-3p表达升高（P＜0.05）；与H/R组比较，山姜素低、中、高剂量组circPRKCI表达升高（P＜0.05），miR-29b-3p表达降低（P＜0.05），且呈剂量依赖性（表3）。

表3 山姜素对H/R诱导的心肌细胞circPRKCI与miR-29b-3p表达的影响（±s，n=9）Tab.3 Effect of alpinetin on expressions of circPRKCI and miR-29b-3p in cardiomyocytes induced by H/R（±s，n=9）

表3 山姜素对H/R诱导的心肌细胞circPRKCI与miR-29b-3p表达的影响（±s，n=9）Tab.3 Effect of alpinetin on expressions of circPRKCI and miR-29b-3p in cardiomyocytes induced by H/R（±s，n=9）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with H/R group，2）P＜0.05；compared with Alpinetin-L group，3）P＜0.05；compared with Alpinetin-M group，4）P＜0.05.

Groups Control H/R Alpinetin-L Alpinetin-M Alpinetin-H F P circPRKCI 1.00±0.06 0.27±0.061）0.49±0.072）0.68±0.052）3）0.85±0.032）3）4）241.752＜0.001 miR-29b-3p 1.00±0.08 3.99±0.661）2.26±0.182）1.77±0.052）3）1.38±0.072）3）4）126.860＜0.001

2.4 circPRKCI靶向调控miR-29b-3p表达circ-PRKCI与miR-29b-3p存在结合位点（图2A）。miR-29b-3p过表达可降低野生型载体WT-circPRKCI荧光素酶活性（P＜0.05，图2B）。circPRKCI可负向调控miR-29b-3p表达（P＜0.05，图2C）。

图2 circPRKCI靶向调控miR-29b-3p表达Fig.2 circPRKCI targeted regulates miR-29b-3p expression

2.5 circPRKCI过表达对H/R诱导的心肌细胞氧化应激、炎症因子、增殖、凋亡及ATP含量的影响 与H/R+pcDNA组比较，H/R+pcDNA-circPRKCI组LDH、MDA、MPO、IL-1β、TNF-α水平降低（P＜0.05），SOD活性升高（P＜0.05），细胞存活率和ATP含量升高（P＜0.05），凋亡率和Bax蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平升高（P＜0.05，表4、图3）。

图3 circPRKCI过表达对H/R诱导的心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响Fig.3 Effect of circPRKCI overexpression on H/R-induced cardiomyocyte apoptosis，Bcl-2 and Bax protein expressions

表4 circPRKCI过表达对H/R诱导的心肌细胞氧化应激、炎症因子、增殖、凋亡及ATP含量的影响（±s，n=9）Tab.4 Effect of circPRKCI overexpression on oxidative stress，inflammatory factors，proliferation，apoptosis and ATP content of cardiomyocytes induced by H/R（±s，n=9）

表4 circPRKCI过表达对H/R诱导的心肌细胞氧化应激、炎症因子、增殖、凋亡及ATP含量的影响（±s，n=9）Tab.4 Effect of circPRKCI overexpression on oxidative stress，inflammatory factors，proliferation，apoptosis and ATP content of cardiomyocytes induced by H/R（±s，n=9）

Groups H/R+pcDNA H/R+pcDNAcircPRKCI t P circPRKCI 1.00±0.04 2.42±0.29 14.552＜0.001 LDH/（U·L-1）328.70±27.82 198.71±10.47 13.119＜0.001 MDA/（nmol·ml-1）4.86±0.47 2.32±0.25 14.314＜0.001 SOD/（U·ml-1）12.26±0.85 24.64±2.31 15.089＜0.001 MPO/（U·g-1）90.78±2.73 51.52±3.88 24.826＜0.001 IL-1β/（pg·ml-1）85.36±2.68 47.20±4.72 21.091＜0.001 TNF-α/（pg·ml-1）120.09±6.30 74.89±5.61 16.074＜0.001 Survival rate（%）28.72±4.10 58.83±6.68 11.525＜0.001 Apoptosis rate（%）29.59±2.71 15.92±0.67 14.691＜0.001 ATP/（nmol·mg-1·L-1）11.07±1.32 17.06±0.73 11.913＜0.001

2.6 干扰circPRKCI表达部分逆转山姜素对H/R诱导的心肌细胞氧化应激、炎症因子、增殖、凋亡及ATP含量的作用 与山姜素高剂量+si-NC组比较，山姜素高剂量+si-circPRKCI组LDH、MDA、MPO、IL-1β、TNF-α水平升高（P＜0.05），SOD活性、细胞存活率和ATP含量降低（P＜0.05），凋亡率和Bax蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05，图4、表5）。

图4 干扰circPRKCI表达部分逆转山姜素对H/R诱导的心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响Fig.4 Interference with circPRKCI expression partially reversed effect of alpinetin on H/R-induced cardiomyocyte apoptosis，Bcl-2 and Bax protein expressions

表5 干扰circPRKCI表达部分逆转山姜素对H/R诱导的心肌细胞氧化应激、炎症因子、增殖、凋亡及ATP含量的作用（±s，n=9）Tab.5 Interference with circPRKCI expression partially reversed effect of alpinetin on oxidative stress，inflammatory factors，proliferation，apoptosis and ATP content of cardiomyocytes induced by H/R（±s，n=9）

表5 干扰circPRKCI表达部分逆转山姜素对H/R诱导的心肌细胞氧化应激、炎症因子、增殖、凋亡及ATP含量的作用（±s，n=9）Tab.5 Interference with circPRKCI expression partially reversed effect of alpinetin on oxidative stress，inflammatory factors，proliferation，apoptosis and ATP content of cardiomyocytes induced by H/R（±s，n=9）

Groups Alpinetin-H+si-NC Alpinetin-H+si-circPRKCI t P circPRKCI 1.00±0.02 0.55±0.03 37.442＜0.001 miR-29b-3p 1.00±0.05 1.70±0.05 29.698＜0.001 LDH/（U·L-1）155.11±8.06 244.21±24.76 10.265＜0.001 MDA/（nmol·ml-1）1.84±0.09 3.30±0.19 20.834＜0.001 SOD/（U·ml-1）26.40±1.93 16.74±0.37 14.747＜0.001 MPO/（U·g-1）37.48±3.41 64.15±3.90 15.444＜0.001 IL-1β/（pg·ml-1）34.97±3.61 71.58±3.01 23.367＜0.001 TNF-α/（pg·ml-1）40.14±5.96 84.09±4.68 17.399＜0.001 Survival rate（%）74.26±5.56 47.22±6.17 9.767＜0.001 Apoptosis rate（%）13.58±0.73 19.48±0.68 17.742＜0.001 ATP/（nmol·mg-1·L-1）18.68±0.44 13.32±0.57 22.331＜0.001

3 讨论

寻找有效干预靶点是心肌缺血再灌注损伤的研究重点，部分中药提取物能够减轻心肌缺血再灌注损伤，但具体作用机制尚未阐明［9］。circRNA在心肌细胞损伤中表达异常，并可参与细胞增殖、凋亡及炎症反应等过程［10］。但circRNA是否可作为中药提取物治疗心血管疾病靶点，以及circRNA是否可作为减轻心肌缺血再灌注损伤的干预靶点均需进一步探究。

山姜素可通过抑制炎症及氧化应激反应减轻脂多糖诱导的干细胞损伤［11］。山姜素可抑制炎症反应及TLR4/NLRP3信号通路减缓急性结肠炎进展［12］。本研究显示，H/R诱导的心肌细胞LDH、MDA水平升高，SOD活性降低，与既往研究结论相似［13］，提示心肌细胞损伤模型建立成功。进一步研究发现，随着山姜素浓度升高，H/R诱导的心肌细胞LDH、MDA水平降低，SOD活性升高，提示山姜素可抑制H/R诱导的心肌细胞氧化应激。心肌缺血再灌注损伤可促进心肌细胞释放MPO、IL-1β、TNF-α等多种炎症递质［14］。本研究显示，H/R诱导的心肌细胞MPO、IL-1β、TNF-α水平升高，而山姜素作用后MPO、IL-1β、TNF-α水平降低，且呈剂量依赖性，提示山姜素可抑制H/R诱导的心肌细胞炎症反应。心肌细胞重要的代谢过程之一是能量代谢，心肌组织损伤时可引起能量代谢障碍从而导致细胞损伤，ATP含量变化可反映细胞内能量代谢［15］。本研究显示，H/R诱导的心肌细胞ATP含量降低，而山姜素作用后ATP含量升高，且呈剂量依赖性，提示山姜素可通过增加H/R诱导的心肌细胞ATP含量而增强能量代谢，从而发挥心肌细胞保护作用。本研究显示，H/R诱导的心肌细胞存活率降低，凋亡率和Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，与既往研究结论相似［16］。进一步研究发现，山姜素处理后H/R诱导的心肌细胞存活率升高，凋亡率和Bax蛋白水平降低，Bcl-2蛋白水平升高，提示山姜素可通过抑制炎症、氧化应激抑制H/R诱导的心肌细胞凋亡，并可通过增强细胞能量代谢促进细胞增殖。

为进一步探究山姜素对H/R诱导的心肌细胞损伤的作用机制，本研究显示，H/R诱导的心肌细胞circPRKCI表达降低，miR-29b-3p表达升高，而山姜素作用后circPRKCI表达升高，miR-29b-3p表达降低，提示山姜素可能通过上调circPRKCI表达及下调miR-29b-3p表达发挥抗心肌细胞损伤作用。研究表明，circPRKCI在过氧化氢诱导的神经元细胞中表达下调，上调其表达可减轻细胞损伤［17］。此外，circPRKCI在胃癌等肿瘤中表达异常，并可通过充当miR-545海绵分子促进细胞增殖及侵袭［18］。本研究显示，circPRKCI过表达可明显降低H/R诱导的心肌细胞炎症及氧化应激，并促进细胞存活及增加ATP含量，还可降低细胞凋亡率。提示circPRKCI过表达可抑制H/R诱导的心肌细胞炎症、氧化应激、凋亡及促进细胞增殖从而减轻心肌细胞损伤。本研究证实，心肌细胞circPRKCI与miR-29b-3p存在靶向调控关系。研究表明，miR-29b-3p在H/R诱导的心肌细胞表达上调，下调其表达可减轻细胞损伤［19］。下调miR-29b-3p表达可减轻烟雾吸入引起的急性肺损伤［20］。本研究显示，干扰circPRKCI表达可通过上调miR-29b-3p表达而逆转山姜素对H/R诱导的心肌细胞损伤的作用。提示circPRKCI/miR-29b-3p轴可能介导山姜素治疗心血管疾病过程。

综上，山姜素可抑制H/R诱导的心肌细胞氧化应激、炎症反应、凋亡，并可增强能量代谢、促进细胞增殖进而对心肌细胞发挥保护作用，circ-PRKCI可靶向调控miR-29b-3p表达，其作用机制与上调circPRKCI表达、下调miR-29b-3p表达有关，为心肌缺血再灌注损伤防治提供了新方向。课题组将进一步探究山姜素是否可通过调控其他circRNA对H/R诱导的心肌细胞发挥保护作用。