CAR-T 细胞治疗儿童复发性B 系急性淋巴细胞白血病所致细胞因子释放综合征临床分析

朱秋皎 潘 涛 柏振江 丁 欣 李 莺

苏州大学附属儿童医院 1.重症医学科，2.新生儿科（江苏苏州 215000）

急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是儿童最常见的肿瘤性疾病,现有的研究显示5年总生存率可达90%以上[1]。但是仍有20%～25%的ALL患儿出现复发，复发后治疗效果差，长期总生存率低于15%～50%[2]。近期I/II期临床试验显示,使用嵌合抗原受体基因修饰T 细胞（chimeric antigen receptor gene-modified T，CAR-T）治疗原发性难治性和复发性ALL能改善这些高危患者的生存趋势[3]，是目前最具应用前景的免疫治疗方法，而以靶向CD19的CAR-T细胞（CD19-CAR-T）治疗B系急性淋巴细胞白血病（B-ALL）疗效最为显著[4]。但是，CAR-T 细胞疗法可能出现细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）、CAR-T相关脑病综合征（CAR-T related encephalopathy syndrome,CRES）、暴发性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（hemophagocytic lymphohistiocytosis，HLH）等毒性反应，其中CRS 是最常见且具有潜在致命的不良反应。本研究收集重症监护病房（pediatric intensive care unit，PICU）接受CAR-T细胞疗法的14例复发性B-ALL 患儿的临床资料，回顾分析患儿在CAR-T细胞输注（CAR-T infusion，CTI）后出现的不同程度CRS的临床特点。

1 对象和方法

1.1 研究对象

收集2019 年1 月至2020 年6 月苏州大学附属儿童医院PICU收治的14例输注了CD19 CAR-T细胞的复发性B-ALL 患儿，均在CTI 前采用环磷酰胺500 mg/(m2·d)×2 d和氟达拉滨60 mg/(m2·d)×2 d进行预处理。入组标准：①难治/复发性B系急性淋巴细胞白血病儿童；②输注CAR-T 细胞后出现CRS表现；③入住PICU时长超过48小时。

1.2 诊断标准

难治/复发性B-ALL 标准：①同种异体造血干细胞移植（HSCT）后骨髓中微小残留阳性或HSCT后髓外复发者；②既往≥2次诱导化疗不缓解，或诱导缓解后微小残留病灶仍阳性，且因各种原因无法接受HSCT者；③Ph(+)，且对酪氨酸激酶抑制剂治疗不耐受或治疗失败。

CRS 定义：任何免疫治疗后导致内源性或输注的T 细胞和/或其他免疫效应细胞激活或参与的超生理反应；症状是进行性的，必须包括开始时的发热，并且可能出现低血压、毛细血管渗漏和终末器官功能障碍[5]。CRS 分级标准[6]：1 级，无危及生命的症状，只需对症治疗，如发热、恶心、疲劳、头痛、肌痛、不适；2 级，症状需要适度干预并缓解，需氧量＜40%或低血压（仅需补液或1种低剂量升压药物），或2级器官毒性；3级，症状需要积极干预才能缓解，需氧量≥40%或低血压（需大剂量或多种升压药物），或3级器官毒性，或4级转氨酶升高；4级，危及生命的症状，需机械通气，或4 级器官毒性（不包括转氨酶升高）；5级，死亡。

第3代小儿死亡危险评分（PRISMⅢ）：入PICU后第1个12 h和24 h进行评估，包括收缩压、心率、体温、PaO2、PaCO2、Glasgow昏迷评分、瞳孔反应、凝血酶原时间/凝血活酶时间、血钾、血糖、pH 值、碳酸氢盐、肌酐、尿素氮、白细胞计数、血小板计数17个生理参数。

器官功能障碍诊断标准：①呼吸衰竭，PaO2/FiO2＜300，需无创或有创呼吸支持；②休克，需使用血管活性药物维持血流动力学[多巴胺＞5 μg/（kg·min）或任何剂量的去甲肾上腺素、肾上腺素及血管加压素]；③肝功能障碍，丙氨酸氨基转移酶升高超过2倍上限或总胆红素≥4 mg/dL；④肾损伤，血清肌酐上升至2 倍以上基线水平；⑤凝血功能障碍，INR≥2。

1.3 研究方法

CD 19 CAR-T 细胞制备方法：采集患儿外周血40 mL，分离获得外周血单核细胞（PBMC），在培养时加入CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激PBMC，24 d及48 h后加入CD19CAR病毒感染2次，使T细胞表达嵌合抗原受体（CAR），然后扩增至第6或第7天，使CAR-T细胞达到临床治疗数量。

标本收集：CTI 后次日起，常规每日监测血常规、C 反应蛋白（CRP）、血清细胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17 A），隔天监测血清铁蛋白、凝血常规。有神经系统症状患儿进行腰穿，同时测定脑脊液细胞因子。

1.4 统计学分析

应用SPSS 23.0 统计软件进行统计分析，符合正态分布的以均数±标准差（x±s）表示，非正态分布的以M（P25～P75）表示；对于分类变量则以比例表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本资料

14例复发性B-ALL患儿中，女5例，男9例；年龄49～160月，中位数为124月（93.3～141.5月）；其中化疗后复发12 例，移植后复发2 例。髓外浸润4例，2例为睾丸浸润，2例累及中枢神经系统，其余10例为骨髓浸润；病程3～51个月，中位时间33个月。CTI剂量为（3～15）×106/kg。

患儿在CTI 后3 天内都出现高热，热峰为40～42 ℃。从CTI后至入PICU的时长为2～6天，中位时长3.5天。小儿死亡危险评分PRISM Ⅲ为6～20分，中位数为14.0（12.0～17.3）分。

2.2 CRS临床表现

CRS 1、2级患儿为0，CRS 3级8例（57.1%），CRS 4、5 级6 例（42.9%）；符合严重CRS 患儿9 例（64.3%）。CRS级别与器官功能障碍及小儿死亡危险评分关系见表1。

表1 14例患儿CRS级别与器官功能障碍及小儿死亡危险评分关系

心血管功能障碍是最常见的临床表现。11 例（78.6%）患儿出现血压下降，需使用血管活性药物升血压，心脏超声及无创心输出量监测提示每搏心输出量正常或升高，外周血管阻力明显降低，符合高排低阻性休克特点。3例患儿出现了严重的难治性麻痹性休克，联合使用多种血管活性药物仍效果不佳死亡。休克出现的中位天数为3天，中位持续天数为3天。

5例（35.7%）患儿出现呼吸衰竭，表现为气促、呼吸困难，伴有低氧血症（PaO2/FiO2＜200），符合急性呼吸窘迫综合征标准，均需要有创机械通气。1例患儿出现肺出血，伴难以纠正的氧合障碍。

10例（71.4%）患儿出现神经系统并发症，惊厥发作为最常见表现，意识障碍者表现为谵妄或昏迷，其中1例出现右侧肢体偏瘫，肌力Ⅱ～Ⅲ级，持续10天后恢复正常。神经系统症状出现的中位天数为4.5天，持续时间较短，中位天数为2天。

7例（50.0%）患儿出现肝功能异常，但未见血清胆红素升高。急性肾损伤不常见（7%），5例患儿接受血液净化治疗的主要目的是为了更快地清除炎症递质。5例（35.7%）患儿有凝血功能障碍，其中1例有肺出血，其他患儿无出血征象。10例（71.4%）患儿出现了多器官功能障碍（受累器官数≥2个），3例死亡患儿累及的脏器数多达4、5个。

2.3 CRS实验室检查结果

CTI后每日监测患儿血清细胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17 A）变化，IL-6及IFN-γ 明显上升，其他细胞因子无明显变化。IL-6（参考值范围：0～20 pg/mL）峰浓度为170.3～887 205 pg/mL，中位数为7 952.5 pg/mL，达峰时间3～8天，中位时间为第4天；IFN-γ（参考范围：0～17.3 pg/mL）峰浓度为238.0～25 959.4 pg/mL，中位数为3 388.4 pg/mL，达峰时间2～7天，中位时间为第4 天。CRS 4、5 级患儿的IL-6 平均水平明显高于CRS 3 级组，差异有统计学意义（P＜0.05），而两组IFN-γ 差异无统计学意义（P＞0.05）。有神经系统症状患儿脑脊液IL-6 峰浓度为155.2～43 898.9 pg/mL，中位数为1 396.6 pg/mL；IFN-γ的峰浓度范围为122.7～3 459.5 pg/mL，中位数为687.9 pg/mL。

11 例（78.6%）患儿CRP 升高，峰值范围21～185 mg/L，中位数43.23 mg/L；所有患儿血清铁蛋白都明显升高，峰值范围430.9～16 500 ng/mL，中位数4 383.3 ng/mL；10 例（71.4%）纤维蛋白原降低（＜1.5 g/L），最低值范围为0.2～1.3 g/L[（0.68±0.32）g/L]。

2.4 CRS治疗和转归

14 例患儿均联合使用广谱抗生素及托珠单抗治疗，7例静脉滴注甲基泼尼松龙或等量地塞米松，3例鞘注地塞米松；5例进行了血液净化治疗，模式为连续静脉-静脉血液透析滤过（continuous venovenous hemodiafiltration，CVVHDF）单用或联合血浆置换（plasma exchange，PE）。

3例（21.4%）患儿死亡，死亡时间为CTI后3.5～8天，中位时间7天；11例（78.6%）好转。入住ICU时长为2～12天，中位时长5天。

3 讨论

CAR-T 疗法是目前主要针对血液系统肿瘤的新型免疫疗法，其中针对B 细胞表面标志物CD 19的CAR-T 细胞临床试验已显示出对B 细胞淋巴瘤、B-ALL等多种血液系统恶性肿瘤有明显的疗效[7-8]。无论是费城儿童医院和宾夕法尼亚大学的单中心研究[9]，还是Maude等[10]进行的全球多中心研究都表明，抗CD19的CAR-T细胞治疗复发/难治性B-ALL可产生高缓解率和持久性缓解。本研究14 例患儿均为复发性B-ALL，其中2 例为移植后复发，符合CAR-T细胞免疫治疗的适应人群。

CAR-T 细胞输注后可靶向识别正常B 细胞或CD 19+的肿瘤细胞，发挥细胞毒作用，释放炎症性细胞因子，在杀伤肿瘤细胞的同时，对机体也造成了不同程度的毒性反应。CRS常发生在CTI后的1～14天[11]，发热是最早的表现，发生在CTI 后的数小时到1周多时间内，热峰常超过40 ℃[5，9，12-13]，本研究所有患儿在CTI 后24 小时内都出现发热，并且热峰超过40 ℃。

除高热、乏力、肌痛等轻症表现，严重CRS的发生率为1%～46%[11-12，14]，通常表现为血管扩张性休克和毛细血管渗漏伴缺氧性呼吸衰竭[12，15]，也可累及其他脏器出现心律失常、心功能障碍、急性肾损伤、肝衰竭、弥散性血管内凝血[16-17]，严重时可出现多器官功能障碍综合征（MODS），甚至危及生命。本研究严重CRS的发生率高达64.3%，明显高于文献报道，考虑原因与本研究只统计入PICU的危重患儿，而未将大部分轻症患儿纳入其中有关。器官功能障碍是严重CRS 的特征，本研究中循环系统受累最为常见，血流动力学表现为高排低阻性休克，常与脓毒性休克难以区分，使治疗方向发生偏差。肝脏是其次受累的脏器，但肝细胞损害程度较轻并且呈可逆性，不伴胆红素升高。其他重要脏器如肺、肾脏等亦为常见的受损器官。本研究发现CRS 越严重，受影响的脏器越多，而难治性休克是导致患儿死亡的主要原因。上述损害多发生于CTI 细胞输注后1周内，提示在1周内需密切监测可能发生的不良事件，尤其是危及生命的情况，循环系统的监测是重点。

神经毒性是CRS 的一种特殊临床表现，也称为CAR相关性脑病综合征（CAR related encephalopathy syndrome，CRES）或免疫效应细胞相关神经毒性综合征（immune effector cell associated neurotoxicity syndrome，ICANS），有meta分析显示其发生率为29%～47%[18]，通常在输注后7天内发生[19]。ICANS表现形式多样，可表现为中毒性脑病，严重时进展为意识障碍、昏迷、癫痫发作、肌无力等[20]。2018年美国血液和骨髓移植协会（ASBMT）发布了ICANS 的分级系统[21]。本研究患儿神经毒性以惊厥发作为主要表现，其次为意识障碍，1 例患儿出现了偏瘫，但所有存活患儿的神经毒性都是可逆的。5 例患儿行头颅影像学检查未见明显异常；7 例患儿腰穿检查发现脑脊液中白细胞数正常或轻度升高[（0～100）×106/L]，蛋白明显升高（1 200～4 275 mg/L），符合脑病的表现，脑脊液中的细胞因子IL-6、IFN-γ升高。Gust 等[22]认为严重神经毒性的发生机制可能是多种细胞因子尤其是IL-6、IFN-γ、TNF-α 的浓度显著升高并激活血管内皮细胞，导致血管功能障碍，血脑屏障通透性增加，后者使CAR-T 细胞向脑脊液迁移，并驱动脑脊液中产生更高的细胞因子，在预防和治疗中枢神经系统白血病的同时诱发神经毒性。

严重CRS 的本质是免疫反应引起的细胞因子风暴，IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF 升高，其中以IL-6 和IFN-γ 升高最为明显。有研究发现严重CRS 患者比轻度或无CRS 的患者具有更高的IL-6、IFN-γ 峰值水平[9]。本研究观察到CRS 程度越严重，IL-6、IFN-γ 峰值水平越高，CRS 3 级组与4、5 级组IL-6 均值存在统计学差异（P＜0.05），而两组间IFN-γ 均值无统计学差异（P＞0.05）。本组3 例死亡患儿的IL-6 浓度更是超过正常范围数千倍（42 463～887 205 pg/mL），但是本研究样本量偏少，IL-6 浓度与CRS 级别之间的联系仍需要进一步探讨。另外本研究发现，IFN-γ 及IL-6的中位达峰时间基本一致，但IL-6的峰值高于IFN-γ，因此认为早期监测血清IL-6浓度更有意义，可以预估CRS的严重程度并及早采取相应措施。

IL-6被认为是介导严重CRS的关键介质[23]，低水平的IL-6 可与膜结合型IL-6 R 结合通过经典信号传导通路发挥抗炎作用，而高浓度的IL-6则与可溶性IL-6R结合通过反式信号转导通路发挥促炎作用[24]。由于条件所限，细胞因子往往不能常规监测，而CRP是肝脏受IL-6刺激后产生的急性反应时相蛋白，Lee等[23]发现IL-6峰值和CRP峰值之间存在强相关性，可以将CRP作为IL-6生物活性的可靠替代指标；同时有研究发现CRP≥20 mg/dL的患者发生严重CRS的风险最高[5，25]。本组部分患儿CRP轻度升高，与IL-6 水平不呈正比，因此CRP 能否完全代替IL-6反映体内的炎症反应以及发生严重CRS的截断值，还需要进一步的大样本研究。

目前认为CRS 的毒性是可逆的，常在数周内缓解，极少数患者出现死亡。托珠单抗（IL-6 R 拮抗剂）是治疗CRS 的一线方案，能减轻或消除CRS 的毒性作用[26-28]。糖皮质激素可快速逆转CRS 症状，但会抑制CAR-T 细胞的增殖和活性，仅作为二线治疗，用于治疗托珠单抗无效的严重CRS患者[27]。根据CRS的分级，托珠单抗用于2级及以上患者，3级及以上患者可使用地塞米松或等剂量的甲基泼尼松龙，危及生命者需要大剂量甲基泼尼松龙冲击治疗[6]。本组14例患儿均使用了托珠单抗，出现神经系统症状的3例患儿给予地塞米松鞘注，3例死亡患儿予大剂量甲基泼尼松龙冲击后仍无法逆转严重CRS的毒性。

针对IL-6 极度升高或激素治疗无效的患者，我们还采取了血液净化方式来快速清除细胞因子，这种治疗方法在目前的CRS管理指南中未曾提及。本组5例患儿实施了血液净化（CVVHDF和/或PE），2例存活患儿在连续血液净化48～72小时后血清IL-6浓度下降90%以上，3 例死亡患儿在连续血液净化24小时后IL-6浓度仍持续上升，并且很快出现多脏器衰竭而死亡。Liu等[29]使用血液滤过成功缓解了1例10 岁男孩的CAR-T 细胞相关毒性，在连续静脉-静脉血液滤过（CVVH）24小时后，患儿IL-6水平迅速下降，各项实验室指标在短时间内恢复。1例23岁的B-ALL 患者在使用托珠单抗和糖皮质激素无效后，连续3 天进行PE 很快缓解了CRS 的症状，并且不影响CAR-T细胞的疗效[30]。因此，血液净化或许是激素无效的严重CRS 患者的有效治疗方式，但是何时开始血液净化、选择何种模式及剂量、血液净化持续的时间等问题仍需要不断探索。

本研究的不足之处在于纳入的样本量少，且为回顾性研究，存在数据缺失，无法通过多因素回归分析来确认死亡的高危因素的缺陷，有待更多的样本或大规模的多中心研究来进一步明确潜在的危险因素，早期干预降低病死率。