阿尔茨海默病患者血清miR-320aAQP4水平变化及临床意义

岳亚敏，郭素彦，杨玉博，康孝理

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种起病隐匿并呈进行性发展的神经系统退行性疾病，以精神行为异常、认知障碍、社会生活功能减退等为主要临床特征，是老年人群失能的重要原因之一[1]。目前尚无药物能阻止AD发生或延缓其进展，早期预防AD发生至关重要[2]。

目前研究认为，AD病理改变的中心环节与β-淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ)在脑内沉积密切相关[3]。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类非编码RNA分子，研究发现miRNA可能在AD发生发展中发挥重要作用[4,5]。miR-320a是一种保守的miRNA，有研究通过检测AD患者脑脊液外泌体中miRNA发现，miR-320a在AD患者脑脊液外泌体中表达下调[6]。水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)是一种跨膜通道蛋白，参与脑实质中水的转运[7]。

实验发现，AQP4基因缺失可导致脑Aβ清除受损[8]。笔者通过在线网站预测发现，miR-320a可与AQP4的3’-非翻译端存在结合位点，推测miR-320a、AQP4可能共同参与AD发生，但关于血清miR-320a、AQP4 水平与AD的关系尚无研究报道，基于此本研究就通过观察AD患者血清miR-320a、AQP4 水平变化，探讨二者与Aβ沉积和认知功能的关系及对AD的诊断价值，旨在为临床防治AD提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月-2022年4月濮阳市油田总医院收治的80例AD患者为AD组，其中男44例，女36例；年龄52～87(63.54±5.68)岁；体质指数19.7～28.3(24.51±2.17)kg/m2；文化程度：高中及以上38例,初中及以下42例。纳入标准：(1)符合《阿尔茨海默病诊疗指南》[9]诊断标准；(2)年龄≥18岁；(3)初诊，入院前未接受AD相关治疗；(4)患者或家属知情并签署同意书。排除标准：(1)合并帕金森病、精神分裂症、人格障碍等其他精神疾病；(2)颅脑外伤、脑血管疾病等脑部损伤导致的认知功能损害；(3)有攻击行为或自杀倾向；(4)有严重躯体疾病；(5)合并严重心肝肾功能损害；(6)合并免疫、造血系统损害；(7)近3个月内急慢性感染；(8)临床资料不全。另选取同期34名体检健康者为对照组，其中男18例，女16例；年龄41～85(61.87±6.21)岁；体质指数22.8～27.2(24.07±1.87)kg/m2；文化程度：高中及以上17例、初中及以下17例。两组一般资料比较无差异(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 方法 收集两组研究对象入院时空腹静脉血6 ml，1500 xg 离心15 min，分离血清并分置两份置于-80 ℃冰箱保存至检测。其中一份采用Trizol法(北京凯诗源生物科技有限公司，编号：SH-2366)提取血清总RNA，茎环法(北京百奥莱博科技有限公司，编号：GS0151-WTP)转录合成cDNA，按照SYBR Green qPCR Mix试剂盒(北京百迈客生物科技有限公司，编号：RK02001)说明书进行PCR扩增，引物设计合成由广州锐博生物技术有限公司完成：miR-320a正向引物：5’-GACTGTGTGGGACTTATTGAGG-3’；反向引物：5’-TGATGTAGTGTGTGGCTGTTGA-3’；内参U6正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反应条件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，循环40次后进行熔融曲线分析，2-ΔΔCT法计算血清miR-320a的相对表达量。另一份采用ELISA(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，编号：E-EL-H0543c、E-EL-H0542c、E-EL-H0490c)测定血清Aβ42、Aβ40、AQP4水平，并计算Aβ42/Aβ40比值。

1.3 认知功能评估 两组研究对象入院后均采用简易精神状态检查表(mini-mental state examination，MMSE)[10]评估认知功能，共6个维度和30个条目，分值0～30分。认知功能损害标准为：文盲患者低于17分；小学文化程度低于20分；中学文化程度低于22分；大学文化程度低于23分。

2 结 果

2.1 AD组与对照组血清Aβ42、Aβ40、Aβ42/Aβ40、miR-320a、AQP4水平和MMSE评分比较 AD组血清Aβ42、Aβ42/Aβ40、miR-320a、AQP4水平和MMSE评分低于对照组，血清Aβ40水平高于对照组(P<0.05)(见表1)。

表1 AD组与对照组血清Aβ42、Aβ40、Aβ42/Aβ40、miR-320a、AQP4水平和MMSE评分比较

2.2 AD患者血清miR-320a、AQP4水平与Aβ42、Aβ40、Aβ42/Aβ40水平和MMSE评分的关系 经https://www.targetscan.org/网站预测，miR-320a与AQP4的3’-非翻译区存在结合位点(见图1)。Pearson/Spearman相关性分析显示，AD患者血清miR-320a、AQP4水平与Aβ42、Aβ42/Aβ40和MMSE评分呈正相关，与Aβ40水平呈负相关(P<0.05)(见表2)。

表2 AD患者血清miR-320a、AQP4水平与Aβ42、Aβ40、Aβ42/Aβ40水平和MMSE评分的关系

2.3 血清miR-320a、AQP4水平对AD的诊断价值 ROC曲线分析显示，血清miR-320a、AQP4水平单独与联合诊断AD的AUC分别为0.802、0.819、0.913，血清miR-320a、AQP4水平联合诊断AD的AUC大于二者单独诊断(Z=2.431、2.416，P=0.015、0.016)(见表3、图2)。

表3 血清miR-320a、AQP4水平单独与联合诊断AD的价值

图1 miR-320a与AQP4的结合位点示意图

图2 血清miR-320a、AQP4水平单独与联合诊断AD的ROC曲线

3 讨 论

AD是一种多因素疾病，尽管近年来石杉碱甲、多奈哌齐等胆碱酯酶抑制剂单药或联合美金刚等谷氨酸受体拮抗剂极大的改善了AD患者症状，但治疗获益有限，未能有效阻止或延缓AD进展[11]。有必要进一步探索AD发生发展相关分子机制，为防治AD提供方向。

Aβ是β淀粉样前体蛋白水解的一种蛋白肽，其在细胞基质沉淀聚集后具备强烈的神经毒性作用，能诱导炎症反应、Tau蛋白过度磷酸化、神经元死亡等一系列病理过程，因此Aβ沉积被认为是AD发生的始动因素[3]。Aβ42、Aβ40是Aβ的C端结构主要形式，AD患者Aβ42、Aβ42/Aβ40降低和Aβ40升高反映脑内淀粉样蛋白沉积[12]。本研究中，AD患者血清Aβ42、Aβ42/Aβ40明显降低，Aβ40水平明显升高，符合AD患者脑内Aβ沉积变化。目前，以靶向Aβ、Tau蛋白单克隆抗体为代表的免疫治疗成为了AD药物研发的热门方向，多种靶向Aβ的单克隆抗体也取得较好的研究成果，但疗效持久性等问题仍待解决[13]。近年来多组学方法研究表明，表观遗传改变能驱动AD的发生[14]。miR-320a基因定位于人染色体8p21.3，能通过调控细胞增殖和凋亡介导神经发育、重塑等行为。近年来研究显示，miR-320a在双向情感障碍、精神分裂症患者脑组织和神经元中异常表达，与脑内病理产物沉积相关[15,16]。本研究结果显示，AD组血清miR-320a水平降低，符合既往研究报道[17]。结果还显示，AD组血清miR-320a水平与Aβ42、Aβ42/Aβ40正相关，与Aβ40水平呈负相关，提示miR-320a水平降低可能通过引起Aβ沉积参与AD发生，其机制可能与miR-320a能抑制磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)有关。PTEN能通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B等信号通路增强Aβ诱导的神经毒性，在AD发生发展中发挥重要作用[18]。在Aβ25-35诱导的AD细胞模型中，miR-320a能靶向抑制PTEN，减弱Aβ25-35对AD细胞的神经毒性[19]。

AQP4是AQP家族主要成员之一，主要分布于脑实质和主要含水间隙交界处，维持脑内水平衡[7]。AQP4还参与神经炎症、神经兴奋性、突触可塑性和维持中枢神经系统离子稳态等多种病理生理过程，与认知功能密切相关[20]。在大脑皮质注射Aβ40诱导的小鼠模型中，研究发现抑制AQP4基因可导致脑内Aβ清除受损[8]。另一项5xFAD小鼠模型中，敲除小鼠AQP4基因后，小鼠脑内Aβ沉积明显增加[21]。这些研究提示AQP4与Aβ清除和沉积密切相关。AQP4基因多态性分析研究发现，AQP4基因多态性能影响大脑Aβ沉积[22]。本研究发现AD组血清AQP4水平降低，与Aβ42、Aβ42/Aβ40正相关，与Aβ40水平呈负相关，提示AQP4水平降低与AD患者Aβ沉积相关，符合上述研究报道结果。其机制可能为低密度脂蛋白受体相关蛋白1(low-density lipoprotein receptor related protein 1，LRP1)作为配体受体协助细胞膜的内吞作用，能促进神经元、星形胶质细胞等细胞对Aβ的摄取和降解，并协助Aβ通过血脑屏障清除[23]。研究表明，AQP4基因缺失能抑制LRP1表达，减少和抑制LRP1对Aβ的清除作用[24]。MMSE为临床AD患者常用智力状态和认知功能评估方式，本研究结果显示，AD患者MMSE评分较对照组显著降低，提示AD患者存在明显的认知功能损害。结果还显示，AD患者血清miR-320a、AQP4水平与MMSE评分呈正相关，分析是miR-320a、AQP4均能影响脑内Aβ清除，影响AD患者认知功能。本研究通过在线网站预测发现，miR-320a与AQP4的3’-非翻译端存在结合位点，相关分析显示AD患者血清miR-320a与AQP4水平呈正相关关系，提示二者可能共同参与AD发生。近期李俐娟等[25]报道也显示，miR-320a能通过上调AQP4抑制Aβ诱导的神经元细胞凋亡。最后本研究通过绘制ROC曲线分析发现，血清miR-320a、AQP4水平均可作为AD辅助诊断指标，且二者联合能提升AD诊断价值。

综上所述，AD患者血清miR-320a、AQP4水平降低，二者与AD患者Aβ沉积和认知功能相关，可作为AD辅助诊断指标。但本研究为单中心研究，可能影响结果准确性，同时本研究仅分析了血清miR-320a、AQP4水平变化，关于miR-320a、AQP4参与AD的机制还需进一步研究。