病原诱导水产动物细胞凋亡途径研究进展

郭梓沣 孙斌斌 柯文杰 杨映 于辉 陈言峰

(佛山科学技术学院 生命科学与工程学院，广东佛山 528231)

细胞凋亡(apoptosis)是基因调控下细胞自主有序死亡的方式。其形态学变化特点是细胞体积变小，胞膜变为泡状，随后与相邻细胞脱离、胞膜内陷以及发生核仁裂解，裂解成多个凋亡小体，最后被吞噬细胞吞噬、消化[1]。细胞凋亡的过程分为4个步骤：细胞接受凋亡信号、凋亡调控分子间的相互作用、蛋白水解酶的活化和进入连续反应过程。病原引发细胞凋亡的途径有外源性途径(死亡受体途径)、内源性途径(线粒体途径)、内质网凋亡途径和caspase(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)通路的激活等。

细胞凋亡在多细胞生物的生长发育和对机体稳态的维持中具有重要作用，但紊乱的凋亡过程也与许多疾病的发生密切相关。当前，水产养殖业为全球经济增长做出了重要贡献。然而，细菌、病毒和寄生虫等病原体的入侵，致使水产动物疾病频频暴发，严重制约了水产养殖业的发展[2]。近年来的研究发现，许多病原在致病过程中能够诱导水产动物细胞发生凋亡。病原体在感染水产动物后，可以通过细胞凋亡的方式影响机体稳态或生长发育，某些病原体还能够诱导免疫细胞凋亡，引起宿主免疫抑制或引起其他组织细胞出现病理性损伤，对宿主生物体的组织造成伤害，最终打破正常情况下生物体内细胞增殖和凋亡的动态平衡，为疾病的产生提供了可能性。因此，研究水产动物的细胞凋亡将有望为某些水产动物疾病的防治提供新思路。本文将目前已报道的关于水产动物病原诱导的细胞凋亡过程及途径进行综述，以期为相关致病机制的深入研究提供参考。

1 细菌性病原与细胞凋亡

细菌的毒力因子主要有内毒素、外毒素、侵袭素和超抗原等，可通过多种机制诱发宿主细胞的凋亡。内毒素的主要化学成分是脂多糖，可通过多个信号转导作用，激活多个转录因子，再经下游的相关受体转导信号激活凋亡蛋白酶，诱发细胞凋亡[3]。超抗原是由细菌编码的蛋白，可以刺激T淋巴细胞(T-lymphocyte)增殖并释放大量的细胞因子，随后引发凋亡[4]。一些动植物的致病菌可以通过Ⅲ型分泌系统(type 3 secretion system,T3SS)将效应蛋白输送进宿主细胞中，改变其功能，从而产生致病效应，包括诱导细胞凋亡[5]。以下分类介绍目前已发现的各种水产细菌性病原的细胞凋亡途径、过程变化及相关的研究进展。

1.1 弧菌科气单胞菌属

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)感染胡鲶(Clariasbatrachus)头肾巨噬细胞(head kidney macrophage，HKM)后，改变了该细胞内钙稳态，并激活了钙蛋白酶-2，从而引发caspase-3介导的细胞凋亡[6]。另外，研究表明，嗜水气单胞菌能够通过外毒素诱导鲫(Carassiusauratus)淋巴细胞的凋亡，但尚未探明参与该过程的外毒素种类，由于嗜水气单胞菌不经激活就能直接诱导淋巴细胞凋亡，因此该菌仍存在着某些未知的引发凋亡的机制和途径[7]。嗜水气单胞菌还能引发鲤(Cyprinuscarpio)的氧化损伤、非特异性免疫反应和自噬，并可能在感染后期引起细胞的凋亡，但具体过程仍需进一步研究证实[8]。

维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)感染鲫24 h后可诱导血细胞胞内钙离子浓度上升和胞内酸化，造成caspase-9与caspase-3酶活力升高和线粒体膜电位降低，最终通过线粒体通路诱发细胞凋亡。在试验鱼的肝细胞和头肾淋巴细胞超微结构上也观察到典型的凋亡特征——空泡化现象和凋亡小体[9]。

1.2 弧菌科弧菌属

哈维氏弧菌(Vibrioharbeyi)的溶血素是重要的致病因子。研究表明，该溶血素可通过caspase-3激活途径介导牙鲆(Paralichthysolivaceus)鳃细胞发生凋亡，并改变鳃细胞的细胞骨架[10]。

鳗弧菌(Vibrioanguillarum)感染花鲈(Lateolabraxjaponicus)后，能诱发其体内淋巴细胞凋亡，且随着感染时间的增加，凋亡细胞数和鳗弧菌的浓度呈正相关[11]。这种凋亡方式既是机体的免疫反应，也是鳗弧菌侵入后引发花鲈体内免疫调节的结果，凋亡的细胞最终被具有吞噬能力的血细胞清除。此外，鳗弧菌也能诱导栉孔扇贝(Azumapectenfarreri)细胞发生凋亡，期间Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)基因的表达能提高细胞的凋亡率，而当该基因表达被抑制时，细胞的凋亡水平则明显降低，其原因为TLR信号通路具有抵御革兰氏阴性菌感染的能力[12]。

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)感染凡纳滨对虾(Penaeusvannamei)后，诱导血细胞中参与三磷酸腺苷(ATP)合成的细胞色素c基因(cytochrome c，CYC)和细胞中caspase-3基因大量转录表达，引发细胞凋亡[13]。其机制为：对虾受到感染后，其体内免疫系统产生的活性氧(ROS)能够抑制细菌，同时，血细胞中的一氧化氮(NO)呈持续上升状态。随着感染时间的增加，ROS和NO将过度累积，当抗氧化系统无法清除过多的ROS和NO时，对虾将通过凋亡的方式清除被感染和受损的细胞。另外，作为凡纳滨对虾抑癌基因(Lvp53)的负调控因子，细胞分裂周期蛋白42(LvCdc42)也参与对虾血细胞的凋亡过程[14]。

副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)感染凡纳滨对虾后，也可通过线粒体途径诱导对虾血细胞凋亡，期间血细胞中的ROS水平也明显升高，在此过程中对虾体内的组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC) sirtuin 6可发挥抗凋亡的作用[15]。

1.3 弧菌科发光杆菌属

美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacteriumdamselaesubsp.piscicida)的外毒素AIP56是一种质粒编码的蛋白质。在诱导鲈鱼(Dicentrarchuslabrax)细胞凋亡期间，caspase-3、caspase-8和caspase-9参与了AIP56诱导的细胞凋亡，而线粒体膜电位的改变、ROS生成与细胞色素c释放的联合检测表明，线粒体也参与了AIP56诱导的细胞凋亡，这证实了该菌可通过外源性和内源性途径诱导鱼类巨噬细胞和中性粒细胞的凋亡[16]。

1.4 其他细菌性病原

鱼师鱼诺卡氏菌(Nocardiaseriolae)水解酶通过细胞凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)诱导宿主细胞凋亡。该过程不依赖caspase家族的凋亡通路，而是与AIF-endonuclease G(Endo G)-Omi/HtrA信号调节通路相关[17]。此外，该菌的酪氨酸蛋白磷酸酶(protein tyrosine phosphtase，PTP)是一种可诱导细胞凋亡的细菌蛋白，主要在胖头鲤细胞系(fathead minnow cells，FHM)细胞中表达。该蛋白在诱发细胞凋亡的过程中，破坏了FHM细胞中的线粒体跨膜电位[18]。李晓琴[19]通过TUNEL法检测了被迟缓爱德华菌(Edwardsiellatarda)感染的大鲵(Andriasdavidianus)的肝、脾组织细胞，结果显示，其细胞凋亡率明显高于未感染组，提示诱导宿主细胞凋亡可能是该菌的致病途径之一。另外有研究发现，鱼立克次氏体(Piscirickettsiasalmonis)能够诱导大马哈鱼(Oncorhynchusketa)的吞噬细胞凋亡，但该凋亡方式的实现途径目前尚不清楚，需要更深入的研究[20]。

2 病毒性病原与细胞凋亡

宿主细胞能通过凋亡的方式抑制病毒的复制和传播，而病毒也可通过诱导和抑制的方式调节细胞凋亡[1]。在感染早期，病毒通过编码抑制蛋白延缓细胞凋亡，为病毒的增殖提供有利条件；在感染后期，病毒则通过编码诱导蛋白诱导细胞凋亡，释放已完成复制的病毒粒子并感染周边的细胞[21]。病毒诱导细胞凋亡一般有两种途径：第一种途径是免疫系统介导的凋亡，主要是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)清除入侵动物体内的病毒，包括自然杀伤(NK)细胞与CTL介导的靶细胞凋亡和CTL分泌穿孔素引发的靶细胞肿胀破裂两种方式[21]；第二种途径是病毒直接调节的凋亡，该机制分为病毒感染诱导与抑制的凋亡，参与病毒感染介导的细胞凋亡有Bcl-2家族、caspase家族、P53、细胞色素c、Fas/Apo-1和FasL系统等。

以下主要介绍病毒通过何种途径诱导细胞凋亡、在该过程中细胞内部有哪些变化和其他有关凋亡的信息[21]。

2.1 虹彩病毒科蛙病毒属

沼泽绿牛蛙病毒(rana grylio virus，RGV)在感染鲤上皮瘤细胞(epithelioma papulosum cyprini，EPC)和FHM细胞时引发的细胞凋亡主要是通过线粒体途径介导的，FHM细胞在感染期间表现为caspase-3和caspase-9活性均升高了[22-23]。灭活的RGV可诱导EPC细胞发生凋亡，这表明EPC细胞的凋亡可能发生在病毒感染的早期阶段[24]。

新加坡石斑鱼虹彩病毒(singapore grouper iridovirus，SGIV)能感染FHM细胞和EPC细胞，进而诱导细胞凋亡[25]。另外，Pham等[26]研究了感染石斑鱼虹彩病毒(grouper iridovirus，GIV)后的虹鳟(Oncorhynchusmykiss)单核/巨噬细胞(RTS11)、大马哈鱼(Oncorhynchusketa)胚胎细胞(Chinook salmon embryo，CHSE-214)和EPC细胞的病理学变化，结果显示，在该病毒复制尚未完成的情况下，仍能诱导RTS11和CHSE-214细胞发生凋亡；此外，经紫外线(UV)处理过的GIV能引起EPC细胞凋亡率升高及RTS11细胞凋亡率降低，但却不能引起CHSE-214细胞发生凋亡。EPC细胞凋亡率的升高可能是因为紫外线影响了病毒的抗凋亡基因，而其他两种细胞发生凋亡有可能是GIV未被紫外线完全灭活所致。

中华鳖虹彩病毒(soft-shelled turtle iridovirus，STIV)感染FHM细胞后，caspase-3和caspase-9被激活，线粒体膜电势降低，导致线粒体膜间隙中的细胞色素c释放到细胞质内，从而引发细胞凋亡，这属于线粒体介导的细胞凋亡途径[27]。

大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus，CGSRV)可通过线粒体途径诱导EPC细胞的凋亡，但该通路中哪种caspase被激活目前尚不清楚，且仍需实验来验证是否外源性途径和内质网途径也参与了该凋亡过程[28]。

2.2 虹彩病毒科淋巴囊肿病毒属

淋巴囊肿病毒(lymphocystis disease virus，LCDV)能够诱导体外培养的牙鲆鳃细胞凋亡，然而该病毒在鱼体内感染时，可以产生一种细胞质肿瘤坏死因子受体(TNFR)样蛋白，该蛋白可能与一个或多个凋亡或增殖信号分子相互作用，从而抑制TNFR超家族下游的凋亡途径，其结果是被感染的细胞受到保护，不会发生凋亡[29]。

2.3 虹彩病毒科肿大细胞病毒属

传染性脾肾坏死病毒(infection spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)诱导鳜鱼(Sinipercachuatsi)脑细胞(CPB)凋亡时存在两种途径：一是肿瘤坏死因子(TNF)介导的外源性途径，其特点是凋亡期间caspase-8水平明显升高；二是磷酸肌醇3激酶(PI3K)介导的线粒体途径，主要机理是在ISKNV感染过程中，PI3K相关的细胞信号通路被激活，P13K活性升高后诱导CPB细胞发生凋亡。另外，ISKNV还可感染石斑鱼鳍细胞系(grouper fin cells，GF-1)细胞，通过促进Fas基因上调与下游caspase-8被激活的途径，诱导细胞凋亡。试验还发现，多不饱和脂肪酸可抑制Fas介导的信号通路，从而减少细胞凋亡数量[30-32]。

2.4 弹状病毒科Sprivivirus病毒属

鲤春病毒血症病毒(spring viraemia of carp virus，SVCV)可同时经过线粒体途径和死亡受体途径诱导EPC细胞的凋亡。该过程中会产生ROS以及生成大量的DNA氧化损伤产物，且细胞凋亡相关因子caspase-3、caspase-8和caspase-9的表达量会升高[33-34]。

2.5 弹状病毒科鲈鱼弹状病毒属

大口黑鲈弹状病毒(Micropterussalmoidesrhabdovirus，MSRV)在诱导鲈鱼(Lateolabraxjaponicas)皮肤细胞凋亡的过程中，caspase-3的活性升高，干扰素相关基因(MDA5、LGP2和IRF3)表达上调，暗示干扰素信号通路对MSRV的复制有重要作用[35]。

2.6 弹状病毒科诺拉弹状病毒属

病毒性出血性败血症病毒(viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV)[36]也可诱导EPC细胞的凋亡，若加入caspase抑制剂Z-VAD(OMe)-FMK后，凋亡会延迟，EPC细胞的存活时间增长，同时VHSV在细胞内复制的时间也会延长。

2.7 鱼蛙疱疹病毒科鲤疱疹病毒属

Lu等[37]认为，鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)感染银鲫(Carassiusauratusgibelio)细胞后可能是通过激活启动子caspase-8和caspase-9以及效应子caspase-3和caspase-7来诱导细胞凋亡，激活的途径主要依赖于內源和外源途径的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。还有报道称，CyHV-2引发异育银鲫细胞凋亡时，具体表现为，该病毒通过编码的miR-C12靶向抑制caspase-8基因的表达，通过抑制细胞凋亡以促进病毒在细胞内复制，而miR-C4则可以促进CyHV-2诱导的细胞凋亡[38]。研究还发现，锦鲤疱疹病毒(koi herpes virus，KHV)感染锦鲤鳍条细胞(Koi-Fin)后，在细胞发生凋亡的过程中线粒体膜电位出现了显著变化[39]。

2.8 鱼蛙疱疹病毒科鱼回疱疹病毒属

斑点叉尾鱼回病毒(channel catfish virus，CCV)感染斑点叉尾鱼回卵巢细胞(channel catfish ovary cells，CCO)后，caspase-3和caspase-8被激活，其活性明显提高，此时发生的细胞凋亡是通过外源性途径实现的[40]。

2.9 其他病毒性病原

白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)感染凡纳滨对虾后，对虾血细胞出现凋亡现象，导致其生理功能丧失甚至死亡，在此过程中，尽管对虾体内的抗凋亡蛋白酪氨酸蛋白激酶(Src64B)发挥着抑制WSSV复制的作用，但无法改变血细胞中的caspase-3和caspase-7活性升高的事实[41-42]。WSSV还能引发拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)细胞的凋亡，具体表现为Bcl-2结合抗凋亡基因1(Bcl-2 associated athanogene 1，BAG1)表达水平的显著上调和caspase-3的活性增强，而敲除BAG1基因后，血细胞凋亡率增加，推测该基因具有抑制细胞凋亡的作用[43]。

赤点石斑神经坏死病毒(red-spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV)感染斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)和纹月鳢(Channaasiatica)时，可通过内源性途径引发细胞凋亡[44]。在此过程中，斜带石斑鱼细胞中的Drp1表达水平及纹月鳢细胞中的EndoG表达水平均上调。RGNNV感染纹鳢(Channastriatus)细胞时，也可通过内源性线粒体途径诱导细胞凋亡[45]。而巨石斑鱼神经坏死病毒(greasy grouper nervous necrosis virus，GGNNV)诱导海鲈鱼(Percafluviatilis)的细胞凋亡却可能是通过外源性途径实现的，其中，鱼体内的半胱氨酸蛋白酶是促凋亡的关键因子[46]。

草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus，GCRV)感染胖头鲤细胞后，能检测到细胞凋亡的早期信号磷脂酰丝氨酸与特征现象，如基因组DNA断裂[47]。GCRV还可感染草鱼肾细胞(Ctenopharyngodonidelluskidney cell，CIK)，表现为caspase蛋白酶活性及CIK细胞的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)和白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)浓度均明显升高，其中TNF-α与受体(TNF-R1)结合后，激活启动子caspase-8和caspase-3，从而导致细胞凋亡[48]。

传染性鲑鱼贫血症病毒(infectious salmon anemia virus，ISAV)是鱼类中的一种正黏病毒(orthomyxo virus)，该病毒能引起大西洋鲑鱼(Salmosalar)的传染性疾病，在感染大西洋鲑鱼头肾细胞(SHK-1)时，通过增强促凋亡蛋白(Bad)的表达和减少Bcl-xl的转录，激活信号转导通路，再通过p38 MAPK介导促凋亡蛋白的表达引发细胞凋亡[49]。

传染性胰腺坏死病毒(infectious pancreatic necrosis virus，IPNV)在18 ℃下是通过激活caspase-8和caspase-3来诱导斑马鱼(Brachydanioreriovar.)肝上皮细胞(zebrafish liver epithelium，ZLE)凋亡的，但其通过何种途径引发细胞凋亡目前尚不清楚[50]。

3 寄生虫性病原与细胞凋亡

寄生虫引发水产动物疾病时，主要引起宿主免疫细胞或组织细胞的凋亡。寄生虫引起宿主细胞凋亡主要通过7种途径：(1)Fas/FasL途径。在凋亡细胞中检测到Fas和caspase表达量较多[51]。(2)TNF受体家族途径。细胞凋亡与TNF受体家族激活相关。(3)caspase家族的激活。细胞凋亡是通过激活caspase酶原引发的。(4)内源性途径。(5)活化诱导细胞死亡。T细胞亚群被激活并发生了凋亡。(6)宿主分泌炎症介质引起的凋亡，即宿主免疫细胞分泌NO或其他炎症介质，引起被感染细胞的凋亡。(7)虫源性分子引起的凋亡。主要是寄生虫分泌的某些蛋白引起宿主细胞的凋亡。

目前寄生虫诱导水产动物细胞凋亡的相关研究报道较少，以下介绍寄生虫诱导细胞凋亡的相关文献信息。

3.1 鲤鱼拟锥体虫

在有NO参与时，鲤鱼拟锥体虫(Trypanoplasmaborreli)能引发健康鲤鱼血小板发生快速的凋亡，以此减弱宿主的免疫反应，表明NO在该寄生虫致病过程中起到一定的辅助作用[52]。

3.2 牡蛎包纳米虫

牡蛎包纳米虫(Bonamiaostreae)活体和热处理后的虫体均可诱导扁平牡蛎和杯形牡蛎血细胞发生凋亡。该过程主要是通过改变细胞内钙离子浓度的变化来调节血细胞中的细胞骨架，进而通过虫体进入宿主细胞而致病[53]。但也有研究发现，被牡蛎包纳米虫感染的牡蛎(Ostreagigastnunb)出现了细胞凋亡被抑制的现象，在不同的致病阶段，凋亡细胞数随之不同，细胞凋亡的激活和抑制则取决于寄生虫与牡蛎之间的侵袭和对抗的程度[54]。

3.3 海水派琴虫

海水派琴虫(Perkinsusmarinus)也能诱导牡蛎血细胞凋亡，但caspases-3在该虫体介导的细胞凋亡调控中作用不明显。此外还发现，经紫外线灭活的海水派琴虫在感染早期(体外感染后45 min)也能刺激宿主血细胞引发凋亡[55]。

4 展望

细菌诱导细胞凋亡是一个复杂的过程。不同的细菌诱导宿主细胞凋亡的机制不尽相同，这可能是由于不同细菌具有不同的毒力因子，而每种毒力因子可能存在特定的细胞凋亡途径。具有多种毒力因子的细菌，存在多种诱导细胞凋亡的途径相互交织共同发挥作用的可能。细菌感染水产动物后，其致病机理是否与细胞凋亡有关，在致病的过程中是否伴随着细胞凋亡，即水产动物疾病与细胞凋亡之间是否存在某种联系，是目前需要研究的内容。若能揭开细菌致病机制与细胞凋亡之间的联系和区别，不仅能对水产动物疾病进行针对性的治疗，还能通过抗凋亡等方式暂缓或抑制水产动物疾病的暴发。

目前的研究认为，病毒引发的细胞凋亡可能是细胞自我保护的一种行为，通过自身凋亡避免更多的邻近细胞被感染[1]。就病毒而言，感染宿主细胞后能编码诱导蛋白和抑制蛋白，即通过自身抗凋亡的调节方式使宿主细胞不会过早死亡，从而使病毒能在宿主细胞内不断增殖；另一方面，病毒也会在完成增殖阶段后快速推进宿主细胞的凋亡，以利于自身的释放和扩散。病毒感染与宿主细胞之间的关系是目前水产领域研究的重点，何种病毒能诱导细胞凋亡、病毒致病机制与细胞凋亡之间的联系以及病毒引发细胞凋亡的途径是目前仍需要深入研究的内容。

寄生虫与宿主细胞之间存在复杂的相互作用,今后还需要有更多的研究去揭示寄生虫调节宿主细胞信号途径并进一步引发细胞凋亡的详细机制，这不仅有助于找到治疗寄生虫病的最佳方法和最适药物，对于阐明寄生虫的致病机制也有着重要的意义。