华南虎外周淋巴血细胞培养及染色体铺展分析

潘天乐，刘凤霞,2，毛毅斌，刘建勋，邹健强，黄海军，林盈,4，杨仙玉，张先福

（1.浙江农林大学 动物科技学院、动物医学院，浙江 杭州 311304；2.贵州韩伟蛋业有限公司，贵州 六盘水 553521；3.杭州野生动物世界有限公司，浙江 杭州 311422；4.杭州博盛科技有限公司，浙江 杭州 310012）

虎Panthera tigris有很多亚种，其中华南虎P.tigris amoyensis是我国所独有的。相关研究基本确定野生华南虎已在自然界灭绝[1]。截至2019 年2 月，全国圈养华南虎仅有178 只，均为近亲交配的后代。近年来，华南虎在繁殖过程中的死胎、弱胎、畸形胎等异常现象愈发频繁，在种群扩大及个体健康方面均面临日益增大的压力。1991—1993 年，张锡然等对华南虎和东北虎P.tigris altaica的染色体核型进行了分析[2-4]，结果表明华南虎和东北虎的染色体数目相同，G-显带带型没有明显差异[5]。2008 年，郑维平等对东北虎的染色体核型进行了分析[6]，研究结果与张锡然等的结果一致。研究华南虎长期近交过程中染色体的核型变化情况，可为圈养华南虎繁殖和疾病诊断提供依据，将有利于其种群数量的扩大和后代的健康。染色体核型分析不仅可以识别染色体的各种不同特征，还有利于对基因的定位研究[7]。它是遗传学中使用的基础技术，也是动物分类、动物育种工作不可或缺的手段[8]。

本文使用人Homo sapiens外周淋巴细胞的培养基成功培养了华南虎外周血的淋巴细胞，并进行了染色体铺展和G-显带，然后对其核型进行了分析，以期为华南虎的遗传性疾病诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血液 华南虎血液（采集自雄性华南虎尾静脉）由杭州野生动物世界提供，并保存于4 ℃冰箱。

1.1.2 试剂和主要仪器 人外周血淋巴细胞培养基、秋水仙素、胰酶、吉姆萨染色液等均购自杭州博盛科技有限公司，甲醇和冰醋酸（分析纯）购自杭州大方化学试剂厂。主要设备有移液枪、超净工作台、生化培养箱、离心机、烘箱和显微镜等。

1.2 试验方法

1.2.1 外周淋巴细胞的培养 将保存于4 ℃冰箱的华南虎血液取出，轻轻颠倒混匀，在超净工作台内，使用1.0 mL 一次性注射器取0.1 mL 接种至5 mL 人外周血淋巴细胞培养基，在37 ℃生化培养箱培养72 h（每隔4～ 8 h轻轻摇匀培养液）。然后在培养基中加入10 μg·mL-1的秋水仙素50 μL，继续培养1.5 h，最后将培养液移入15 mL离心管，1 500 r·min-1离心10 min（后续离心条件与此相同），管内保留上清液与沉淀约0.5 mL。

1.2.2 低渗处理 在每个离心管内各加入3 mL 于37 ℃预热的0.075 mol·L-1KCl 溶液，用巴氏管充分吹打混匀细胞悬浮液，然后于37 ℃水浴30 min。

1.2.3 固定 遵循杭州博盛科技有限公司人外周血淋巴细胞培养基的产品说明，对细胞进行固定，固定液为甲醇与冰醋酸3∶1（体积比）的混合物，共分3 个步骤：第一步为初固定，即向每个离心管内加入0.25 mL 固定液，轻轻吹打混匀，室温放置5 min 后离心，保留上清与沉淀共1 mL；第二步为第一次固定，即向初固定的样品中加入固定液3 mL，吹打混匀，室温放置5 min 后离心，保留上清液与沉淀共1 mL；第三步为第二次固定，与第一次固定基本相同，不同的是离心后去掉全部上清液，在沉淀中加入0.5 mL 新鲜固定液。

1.2.4 染色体铺展与吉姆萨染色 将于冰柜中预冷的载玻片沿瓷盘边缘倾斜放置，然后用巴氏管吸取适量固定好的细胞悬浮液，从40～ 50 cm 高度滴到玻片上，然后连同瓷盘小心放入80 ℃烘箱（开启风机）。待玻片干透后（3～ 5 min）取出瓷盘，将玻片用自来水迅速冲洗，甩干，然后将吉姆萨染液（原液∶蒸馏水∶磷酸盐缓冲液=1∶8∶1，体积比）覆盖整个玻片，染色3 min 后，甩掉玻片上的染色液，用流水冲洗，甩干后镜检（或存放于玻片盒内）。

1.2.5 染色体G-显带（1）准备：取3 个染色缸，分别标记为1、2、3 号。1 号缸加入胰酶工作液（45 mL 生理盐水+5 mL 胰酶液+150 μL 5%碳酸氢钠），2 号缸加入30 mL 生理盐水，两者均于37 ℃水浴保温，3 号缸加入50 mL 吉姆萨染液置于室温。（2）染色：将从烘箱中取出的玻片冷却至室温，浸入1 号缸处理10 s，取出后快速浸入2 号缸，然后将玻片取出并轻轻甩一下，再插入3 号缸染色3～ 5 min，最后取出玻片用自来水彻底冲净并快速烘干，镜检（或存放于玻片盒内）。

1.2.6 染色体核型分析 采用Photoshop（Adobe Photoshop cc 2015.5）进行染色体核型分析[9]：（1）对染色体图片进行滤镜处理、裁剪和同源染色体配对并编号；（2）新建Photoshop 空白页，拖入同源染色体并垂直放置；（3）测量染色体长臂和短臂的长度并记录数据；（4）根据Levan 等（1964）的计算公式，计算染色体相关参数值[3]。

2 结果与分析

2.1 染色体数目

实验结果表明，染色体铺展良好（图1），2n=38。

图1 华南虎染色体数目Figure 1 Chromosome number of P.tigris amoyensis

2.2 染色体核型

选择6 个铺展良好的华南虎淋巴细胞染色体进行切割和染色体长臂、短臂的准确测量，根据Levan 等的染色体标准计算公式[3]得到华南虎染色体相关参数值（表1）。染色体核型见图2。通过分析观察发现华南虎染色体核型公式为：6（m）+6（sm）+3（st）+2（t），X,Y（m,m），其中第12 对为随体染色体。

图2 华南虎染色体核型Figure 2 Chromosome karyotype of P.tigris amoyensis

表1 华南虎染色体相关参数值Table 1 Chromosome traits of P. tigris amoyensis

2.3 G-显带

依据1997 年Cho 等提出的染色体G-显带分类方式[10]，对华南G-显带染色体进行排版分析和配对，发现华南虎染色体G-显带带形特征分为6 型（图3），其中A 型（大近中央着丝粒染色体）6 条、B 型（大近端着丝粒染色体）8 条、C 型（大中央着丝粒染色体）4 条、D 型（小近中央着丝粒染色体）8 条、E 型（小中央着丝粒染色体）6 条、F 型（端着丝粒染色体）4 条和性染色体X、Y。

图3 华南虎G-显带Figure 3 G-banding of P.tigris amoyensis

G-显带结果表明，华南虎D3 染色体长臂缺少一条深染带、C1 和F2染色体发生了单体异态现象，表明染色体的结构发生了变化。

3 结论与讨论

3.1 结论

本试验结果表明，华南虎染色体铺展良好（图1），可清晰地观察到38 条染色体。该方法使华南虎的淋巴细胞生长良好，降低了工作强度，减少了试验时间，提高了实验效率。本试验华南虎外周血细胞染色体的铺展结果与张锡然等[2]的结果相同，与东北虎等猫科Felidae 动物的染色体数目[5]一致。与张锡然等[2]得到的结果相比，本试验得到的华南虎D3 染色体长臂缺少一条深染带、C1 和F2 染色体发生了单体异态现象，可能是华南虎的染色体发生了变化。

3.2 讨论

有关染色体的研究显示，染色体疾病一般涉及多系统、器官、组织，目前临床对其治疗并无有效方法；染色体疾病表现多样，轻微畸变者能够出生，但多发畸形或形成癌症三倍体[11]。部分染色体微缺失者表型无异常，但传递给后代时配子不平衡，发生不育[12]。严重畸变者宫内死亡或自然流产[13]。本研究得到的华南虎染色体核型为6（m）+6（sm）+3（st）+2（t），X,Y（m,m），与张锡然等的研究结果相同[2]。但G-显带结果表明，华南虎D3 染色体长臂缺少一条深染带，C1 和F2 染色体发生了单体异态现象，表明染色体结构发生了变化。染色体结构异常可导致新生个体出生后发生异常，比如人的21 三体综合征。该疾病是由于染色体21q22 区域的重复，使这一区域呈现三体，从而在临床上导致新生儿肌肉张力不足、寰枢不稳、神经元密度降低、小脑发育不全、智力残疾，甚至伴有先天性心脏病[13-14]。本试验发现的华南虎染色体变化可能是长期近亲交配的后果。异常的染色体结构常导致卵母细胞质量下降或受精卵形成后胚胎发育异常，最终导致流产、死胎以及出生缺陷等情况的发生[15]，因此本试验结果表明，华南虎D3 染色体长臂的缺少可能是导致华南虎经常性流产、死胎以及繁殖力降低的重要原因。

以上研究结果为华南虎配种亲本的选择及后期种群的扩繁提供了重要依据，对我国华南虎繁殖实践具有指导意义。