角膜上皮和基质对角膜上皮基底膜再生的影响

罗煜青 综述 李霞 审校

广西医科大学第一附属医院眼科，南宁 530021

基底膜是一种高度特化的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，广泛存在于人体中。近年来研究发现，在组织损伤后，基底膜通过限制纤维化相关因子参与调节组织的纤维化愈合过程。角膜透明性对于维持其光学特性至关重要。角膜上皮基底膜(epithelial basement membrane，EBM)是介导角膜基质纤维化的重要调控结构。因此，EBM的损伤修复及其与角膜基质纤维化的关系是研究组织纤维化的代表性系统之一[1-3]。本文就基底膜的认识发展、角膜EBM的成分与功能、角膜EBM再生与角膜基质纤维化的关系、EBM再生的影响因素与相关治疗方法进行综述，以帮助临床医生从角膜损伤后的病理生理方面理解角膜瘢痕形成的过程及如何减轻角膜瘢痕化。

1 基底膜和角膜EBM概述

1.1 基底膜的认识发展及功能概述

在19世纪中期，研究者首次于光学显微镜下发现上皮与内皮均附着在一层连续、柔软的基底膜上。基底膜广泛存在于人体各器官中[4]。近年来研究发现，基底膜具有多种生物学功能，其可为上皮、内皮或实质细胞提供黏附，并将其与结缔组织、神经和肌肉分开；同时，基底膜可作为指导形态发生变化和组织修复的支架。基底膜介导的细胞信号通路和细胞变化受到组织特异性基底膜成分和结构的影响[1]。

1.2 角膜EBM

角膜EBM位于角膜上皮与基质之间，是一层高度特化的ECM。在透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)下EBM厚度为50～100 nm，由透明层和致密层构成。EBM的主要成分包括层黏连蛋白(laminin，LM)、Ⅳ型胶原(collagen Ⅳ，ColⅣ)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)和巢蛋白[5-6]。LM是EBM成分中最丰富的非胶原蛋白，它们可以自聚集形成网络，启动EBM的再生过程。LM还可以调节上皮细胞的迁移、分化，促进伤口愈合。这个作用是LM通过其亚基与整合素受体或非整合素受体结合，将EBM与上皮黏附而实现的[5-7]。ColⅣ自聚集形成的网络决定了EBM的稳定性，ColⅣ网络的解体将导致EBM降解。ColⅣ以组织特异性的方式结合可溶性糖蛋白、蛋白聚糖和生长因子，完善EBM的屏障功能[1,8]。HSPG通过与其他EBM成分相互作用，参与组成完整的EBM。HSPG通过与多种表面受体结合，如成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、上皮生长因子、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子，调节细胞增生、迁移和分化[9]。巢蛋白与EBM其他成分有良好的亲和力，是EBM中重要的连接元件。在人体内有巢蛋白1和巢蛋白2共2种亚型，二者相互代偿，单一亚型的缺失不会导致EBM改变[6]。

2 角膜透明性的维持及角膜基质纤维化

2.1 角膜基质透明性的维持

角膜位于眼的最前部，约占屈光度的70%。角膜的透明性保证了光线的传输[10]。角膜基质占人类角膜厚度的80%～90%。正常的角膜基质由ColⅠ和ColⅤ构成。不同类型的胶原紧密堆积，形成平行分布的板层[3,11]。此外，富含亮氨酸的蛋白多糖在ECM中具有重要的结构作用，其指导、调节胶原纤维生长、纤维组织及ECM组装。并且，富含亮氨酸的蛋白多糖胶原纤维可调节纤维间距，精确组织胶原纤维。精密的胶原纤维网络可以减少光的散射，维持角膜基质的透明性[3,12]。

2.2 角膜基质纤维化

外伤、手术、感染和疾病发生后，角膜常发生基质纤维化，而基质纤维化是角膜瘢痕的病理学本质。角膜基质纤维化的产生是一个动态级联的过程，包括角膜基质细胞的激活、细胞因子的释放和ECM异常沉积[13]。

在角膜上皮损伤后，伤口下基质立刻出现细胞凋亡，形成无细胞区域。随后，周围的基质细胞被激活并发育为成纤维细胞。成纤维细胞迁移至伤口区，并分泌ECM填补伤口。在伤口闭合后，成纤维细胞退化为基质细胞，重新分泌正常的胶原纤维和蛋白多糖。这一过程使角膜恢复透明。若角膜严重受损，上皮及泪液中的纤维化相关因子TGF-β1持续以高浓度渗入基质，成纤维细胞将在其作用下继续发育为肌成纤维细胞并长期存在于伤口区。肌成纤维细胞本身不透明，并分泌紊乱的ECM，这些特性破坏了角膜的精确组织结构，直接形成角膜瘢痕[13-15]。

3 EBM损伤修复与角膜基质纤维化

EBM是介导角膜基质纤维化的重要调控结构[1]。在正常角膜中，TGF-β1存在于角膜上皮及泪液中，完整的EBM可阻止TGF-β1进入基质，角膜基质细胞处于静止状态。一旦EBM受损，TGF-β1就可以渗入基质，激活角膜基质细胞，启动角膜纤维化过程。当EBM完全再生后，EBM阻断TGF-β1进入基质，肌成纤维细胞凋亡，正常基质细胞重新填充伤口区，角膜恢复透明[13,16]。

3.1 EBM损伤与角膜基质纤维化

在角膜上皮擦伤、干眼、糖尿病角膜病变、圆锥角膜等疾病早期，仅有角膜上皮轻微受损，上皮细胞经过迁移、增生、分化后迅速覆盖伤口，角膜往往不留瘢痕[2,17-20]。而在准分子激光屈光性角膜切削术(photorefractive keratectomy，PRK)中，角膜中央上皮、EBM与部分基质被去除，术后1个月内，所有患者均会出现角膜混浊，并在12～24个月内出现明显混浊，之后逐渐减轻。这是因为PRK破坏了角膜中央EBM，TGF-β1可以渗入基质并启动纤维化过程。与PRK相比，准分子激光角膜原位磨镶术通过建立上皮-基质皮瓣，保留了角膜中央完整的EBM。因此，术后角膜混浊仅存在于皮瓣边缘，而角膜中央混浊少见。飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术(small incision lenticule extraction，SMILE)仅从角膜侧切口取出基质，尽可能保留了完整的角膜结构[21-22]。Sun等[23]仅在SMILE侧切口处发现少量肌成纤维细胞。

在严重的外伤、感染及化学烧伤中，角膜往往在愈合后形成致密混浊。在角膜严重损伤中，角膜上皮、EBM、基质均受到广泛损伤，EBM无法在短时间内再生[2]。Torricelli等[24]对屈光度为-9.0 D的兔眼行PRK术后观察发现，角膜在术后1个月仍明显混浊，TEM下未观察到EBM再生，结果表明在角膜严重损伤后，即使伤口闭合，在EBM未再生的情况下，角膜混浊将持续存在。

3.2 EBM再生与角膜基质纤维化消退

在角膜损伤后，EBM再生与角膜基质纤维化消退密切相关。Santhanam等[25]通过对比屈光度为-4.5 D的兔眼PRK术后(-4.5 D组)与屈光度为-9.0 D的兔眼PRK术后(-9.0 D组)角膜情况，发现在8～10 d内-4.5 D组兔角膜恢复透明，TEM下观察到EBM的完全再生，角膜前基质未发现肌成纤维细胞。相反，-9.0 D组在术后1个月时角膜仍然混浊，TEM下未观察到EBM再生，角膜前基质存在大量肌成纤维细胞。Marino等[26]对屈光度为-9.0 D的兔眼行PRK术后观察发现，角膜在术后1个月时呈致密混浊，TEM下观察未发现EBM结构；2个月时，兔眼混浊区域出现局灶性透明，TEM下观察可见EBM局部完全再生；4个月时，角膜完全恢复透明，TEM下观察可见EBM完全再生，肌成纤维细胞消失。因此，他们推测角膜基质纤维化的消退与EBM完全再生有关，并认为EBM是介导角膜基质纤维化的重要调控结构。

4 EBM再生的影响因素

EBM受损后，其能否迅速再生并恢复原有功能是决定角膜愈合结局的重要因素。因此，促进EBM再生可能是使混浊角膜恢复透明的重要手段。

4.1 EBM再生的过程及必要条件

目前的研究表明，EBM再生的起始步骤是角膜上皮细胞分泌的LM自聚集形成的网络[7,27]。在LM形成新生EBM后，角膜基质细胞必须参与后续EBM成分的提供[5]。因此，角膜上皮持续不愈合将导致LM合成不足，无细胞表面黏附，无法形成初始的EBM。若角膜基质缺损严重，则基质细胞无法提供后续EBM成分，亦无法生成初始的EBM。若角膜基质缺失严重，则基质细胞无法提供后续EBM成分，亦无法形成新生的EBM。

4.2 角膜上皮对EBM再生的影响

角膜上皮持续不愈合是导致EBM无法正常再生的重要因素。Wilson等[28]对屈光度为-4.5 D兔眼行PRK术后3～4周发生的角膜上皮持续缺损进行观察，发现上皮若未在损伤后10～14 d愈合即会导致角膜基质纤维化，即使该伤口在损伤后3～4周闭合，也不会有EBM再生。在重症干眼、糖尿病角膜病变、圆锥角膜和严重的角结膜炎中，疾病早期常表现为角膜上皮受损。随着病程延长，若角膜上皮长期不愈合，最终均会出现不同程度的角膜混浊[29-32]。

角膜上皮缺损可从以下几个方面影响EBM再生：(1)LM作为EBM的主要成分，主要由角膜上皮提供，负责启动EBM的再生过程。角膜上皮持续缺损导致LM分泌不足，无法自组装形成连续的LM层。只有当角膜上皮愈合后，角膜上皮细胞分泌足够的LM并将其锚定在上皮基底细胞表面才能形成连续的LM层[33-34]。(2)上皮缺损导致EBM与上皮锚定异常，直接影响EBM的正常功能。在圆锥角膜、角膜营养不良、糖尿病角膜病变、药物性角膜病变等疾病中，均出现了上皮基底细胞数量减少、EBM与上皮锚定异常的情况[35]。这些疾病往往在晚期出现角膜混浊。(3)炎性因子白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)的作用。在角膜损伤后，泪液中IL-1分泌增加，它可直接激活Fas-Fas配体系统，诱导角膜基质细胞凋亡；其次，IL-1可驱化骨髓源性纤维细胞达到伤口区，这些成纤维细胞到达伤口区后，可发育为肌成纤维细胞，参与角膜基质纤维化过程；同时，IL-1可驱使中性粒细胞等炎性细胞释放MMP作用于伤口区[16,36]。MMP直接作用于细胞外基质蛋白和组成组织的分子，其中MMP-2与MMP-9可以直接降解EBM中ColⅣ组成的网络，导致EBM降解[37]。MMP的持续升高可直接导致角膜上皮的持续缺损及EBM缺失。在复发性角膜糜烂、角结膜炎、糖尿病角膜病变中均可检测到泪液中MMP含量的增加[32,37-38]。一旦上皮愈合，来自泪液和角膜上皮的IL-1和MMP就不能穿透上皮，继续作用于基质[39-40]。

因此，在角膜损伤后如何快速促进上皮愈合是减少EBM损害、促进EBM再生的重要手段。临床上常用的治疗方法包括：(1)配戴角膜绷带镜 配戴角膜绷带镜能减轻有害物质和瞬目对角膜上皮的进一步损害[41]。(2)人工泪液点眼 使用人工泪液点眼可通过改善泪膜稳定性而保护角膜上皮。有研究表明，透明质酸可以促进角膜上皮细胞的迁移[42]。(3)局部使用类固醇类药物 结膜下注射或滴注类固醇药物能减少角膜伤口区中性粒细胞的迁移，减轻炎症对角膜上皮的影响[43]。(4)局部或全身使用四环素类似物 多西环素及阿奇霉素除抗菌作用外，能直接抑制MMP对EBM和基质的溶解。在反复不愈合的角膜伤口中，局部使用(结膜下注射或点眼)和口服四环素类似物可以促进角膜上皮化，减少角膜瘢痕形成[43-44]。(5)自体血清点眼 自体血清内含有多种抗炎物质，在长期不愈合的角膜中，可明显促进上皮愈合[45]。(6)角膜缘干细胞移植 对于角膜缘干细胞受损而导致上皮持续不愈合的患者应积极进行角膜缘干细胞移植，以恢复角膜上皮的更新能力，维持角膜上皮细胞的功能[41]。

4.3 角膜基质对EBM再生的影响

基质缺损程度也是影响EBM再生的重要因素。与角膜的严重损伤相比，在较轻的角膜损伤中EBM完全再生和角膜恢复透明的时间均明显较短，而在大范围角膜损伤中，如穿通伤、化学烧伤、感染等，EBM出现延迟再生或缺陷再生，甚至不再生[46-48]。在大范围角膜损伤中，肌成纤维细胞数量更多，角膜混浊更明显且更不易消退。

角膜基质主要通过以下方面对EBM再生造成影响：(1)角膜基质细胞在受损时高表达EBM成分。有研究表明，在兔角膜损伤后，角膜基质高表达EBM成分，如巢蛋白、基底膜聚糖和ColⅣ。并且，在较轻的角膜损伤中，EBM成分表达量明显多于较重的角膜损伤[25]。Torricelli等[49]在人角膜的试验中观察到了类似的结果。(2)正常角膜基质需要接近新生EBM，才能为EBM再生提供原料。角膜损伤修复过程中缺损的基质部分由肌成纤维细胞及其分泌的紊乱的ECM填充，这一状态是造成角膜基质细胞无法接近新生EBM的因素[26,48]。体外研究表明，肌成纤维细胞内弥散表达EBM成分，无法为EBM再生提供原料[50]。(3)角膜基质表面的规则程度可以影响EBM再生。Netto等[51]利用准分子激光路径中定位的细网筛在兔角膜表面模拟PRK术后基质表面的不规则，结果发现基质表面越不规则，EBM再生越慢。基质表面的不规则不利于LM形成连续的新生EBM，也不利于后续正常基质细胞定位提供EBM成分[52]。

减少角膜基质损伤、保留足够数量功能正常的基质细胞和减少基质表面不规则是促进EBM再生的重要手段。临床上针对角膜基质损伤的治疗方法较少，常用的方法有：(1)配戴角膜绷带镜 配戴角膜绷带镜可及时阻断有害物质对角膜基质的进一步损害[53]。(2)丝裂霉素C(mitomycin C，MMC)点眼 PRK术后常用MMC点眼减轻角膜基质纤维化。MMC通过抑制分化活跃的肌成纤维细胞及其前体细胞的生长发育，为正常基质细胞重新填充受损区域提供有力条件，促进EBM再生，以恢复角膜透明[52]。(3)羊膜移植 羊膜与角膜具有相似结构，可以直接覆盖伤口达到暂时替代EBM的作用，重建眼表[54]。(4)激光治疗性角膜切削术(phototherapeutic keratectomy，PTK) PTK在已经产生瘢痕的角膜中使用激光去除混浊的前基质，并创造一个平滑的基质表面，为EBM再生提供良好的环境[55]。近年来在体外研究中，组织工程学使用角膜基质细胞3D培养模型模拟角膜基质细胞微环境。该模型通过抗坏血酸诱导角膜成纤维细胞产生ECM。这种自组装的ECM有助于研究各类生长因子在伤口愈合和组织再生中ECM沉积和重塑的作用[56]。

5 小结

角膜EBM与角膜基质纤维化的发生和发展密切相关。EBM能特异性阻止纤维化因子TGF-β1持续渗入基质，是角膜纤维化愈合过程中的重要调控结构。角膜损伤是否破坏EBM影响角膜愈合的结局，在角膜损伤修复过程中，EBM是否及时并完全再生是角膜瘢痕能否减轻，甚至恢复透明的重要因素。角膜上皮为EBM再生提供的初始物质LM和锚定结构是EBM再生的起始步骤。角膜上皮的迅速愈合也阻止了炎性因子IL-1和MMP的作用。因此角膜上皮快速愈合能有效促进EBM再生。正常的角膜基质细胞通过靠近新生EBM，为后续EBM再生提供所需原料。光滑的角膜基质表面为EBM再生创造有利环境。在临床工作中，促进角膜上皮迅速愈合、保存足够数量功能正常的基质细胞和创造光滑的角膜基质表面是EBM再生的重要因素。但是针对角膜基质损伤的有效治疗方法仍较少，现阶段常使用体外模型研究各类生长因子对角膜ECM重塑的作用。

利益冲突所有作者均声明不存在任何利益冲突