间充质干细胞外泌体作用及机制的研究进展

余 静(综述)，许 力(审校)

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)作为一种多能干细胞，具有多向分化为多种组织细胞的潜能，从而在组织修复、提高造血干细胞植入能力、免疫调节等方面发挥作用。Keshtkar等研究表明MSCs主要是通过产生细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)或旁分泌生物活性因子发挥治疗作用，而不是依赖其多向分化的能力。外泌体是EVs的一种，既有母细胞的特异性表面标记，又可携带母细胞的遗传信息，在细胞间进行信息的传递和交流，从而发挥相应的生物学效应。MSCs外泌体是MSCs分泌到细胞外的一种纳米级膜性囊泡，含有大量的生物信息传播介质，并且可以选择性地将含有的蛋白质、RNA等递送至受体细胞，调节细胞间的信号转导。因此，本文就MSCs及其外泌体生物学特性及功能、MSCs外泌体在不同疾病中的作用机制进行综述，讨论MSCs外泌体作为一种替代细胞治疗的应用前景。

1 MSCs生物学特性及功能

随着细胞治疗的发展，MSCs的再生潜能被应用于各种疾病治疗中。目前MSCs的具体作用机制仍未完全清楚，但主要从以下几个方面发挥作用：(1)旁分泌作用：通过分泌多种生长因子和细胞因子，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖和损伤细胞的再生。(2)免疫调节作用：通过与免疫细胞相互作用，抑制机体过度免疫反应，诱导免疫耐受，并可通过促进调节性T细胞的产生和扩增，抑制自身反应性效应T细胞的应答。(3)黏附和迁移作用：在组织损伤或炎症反应的信号刺激下，MSCs可迁移和归巢至受损组织部位，发挥相应的组织修复能力。目前，MSCs已经应用于血液系统疾病、结缔组织病、心血管系统疾病和脑血管系统疾病的治疗，另外MSCs在治疗神经损伤、心肌梗死损伤等也有一定的作用，取得了较好的治疗效果。尽管如此，MSCs疗法仍然有一定的局限性。MSCs供体异质性、体外扩增和长期保存等问题限制了MSCs疗法的临床应用。在标准化的MSCs分离、培养、扩增和治疗程序之前，需要精确评估MSCs细胞群体中干细胞所占的比例。MSCs增殖能力有限，会发生衰老导致干性丢失，并释放组织因子影响非衰老细胞的活性。而且随着干细胞研究的深入，发现MSCs进入体内之后，免疫抑制与免疫调节的不可控性、潜在的致瘤性、非治疗目的分化以及异常堆积等，都极大地限制其在临床的应用及影响患者的预后。因此，寻找一种既能够替代MSCs，又具有上述MSCs活性的物质尤其重要。

2 MSCs外泌体生物学特性及功能

EVs是各种细胞分泌至胞外的膜结合小泡，根据大小和形态的不同，EVs分为外泌体(直径40～100 nm)、细胞微泡(直径100～1 000 nm)和凋亡小体(直径100～5 000 nm)。外泌体可以运输和传递信号，调节各种生物学过程，是细胞间信息交流的重要媒介。随着机体生理状态或病理生理的改变，外泌体的分泌及外泌体包裹的内容物也随着其组织起源和外在环境改变而变化。因此，不同组织来源的外泌体所含遗传物质也不同，执行的功能也不同。外泌体可以作为抗原提成囊泡，在诱导免疫耐受、促血管生成、T淋巴细胞失活、抑制免疫反应中起重要作用，并通过调节肿瘤细胞的黏附趋化作用促进肿瘤细胞的侵袭、转移和进展。同样，外泌体在维持体内稳态、参与凝血过程、对刺激信号(如感染、损伤和疾病等)作出适应性反应、启动自我保护机制和促进组织修复等方面具有重要作用。MSCs外泌体采集过程相对简单，操作性和可控性强，可在低温中长期保存，且生物活性维持更久，在所有可以产生外泌体的细胞中，MSCs来源的最多。MSCs来源的外泌体与其他细胞来源的外泌体在生物学特征和培养储存上没有明显差异，除了表达膜标记分子CD9和CD81，还表达黏附分子，如CD29、CD44和CD73等。MSCs来源的外泌体大小为30～120 nm，能通过血脑屏障，免疫原性低，半衰期长，能进行长时间、远距离的运输。外泌体含有大量的生物信息传播介质，如miRNA的遗传信息及其他一些具有生物活性的物质，并且可以选择性地将含有的蛋白质、RNA等递送至受体细胞，调节细胞间的信号转导。

3 MSCs外泌体在不同疾病中的作用及机制

MSCs外泌体目前主要应用在骨组织及皮肤组织损伤修复、心肌损伤及抗移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)等方面，其主要作用机制是通过与靶细胞膜融合，将其内容物释放入靶细胞内或与靶细胞表面受体相互作用，激活靶细胞内信号通路，通过影响靶细胞的生物学功能发挥作用。

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MSCs外泌体在关节软骨损伤修复中的作用及机制 骨关节炎病理过程复杂，以关节软骨损伤和退化为特征，是致残的重要原因，骨关节炎患者关节软骨修复再生能力较差，MSCs外泌体可通过促进软骨细胞增殖、分化和迁移，进而促进关节软骨的修复。其机制主要是MSCs外泌体增强Ⅱ型胶原和硫酸糖胺聚糖等细胞外基质的合成，增加软骨细胞中成软骨基因Ⅱ型胶原a1(Col2a1)和蛋白聚糖表达，降低了软骨细胞肥大标志物基质金属蛋白酶13和转录因子Runx2的表达，减弱了促炎因子IL-1α诱导的软骨细胞增殖抑制和凋亡，进而促进关节软骨恢复。Liu等发现MSCs外泌体可通过靶向调控改善软骨细胞损伤。Zhang等发现MSCs外泌体通过激活腺苷介导的AKT和ERK信号通路，增加软骨细胞增殖浸润并迁移至缺损部位进而促进软骨修复，还可通过激活SMAD信号通路促进软骨细胞基质合成，并可增加M2型巨噬细胞的浸润伴随着滑膜促炎性细胞因子IL-1α和TNF-α的减少可重建软骨细胞免疫表型，促进软骨的修复。Wu等发现，骨关节脂肪MSCs来源的外泌体通过调节miR-100-5p抑制mTOR自噬信号途径，增强关节软骨细胞基质合成，抑制细胞凋亡，保护关节软骨免受炎症损伤，维持关节软骨稳态，并认为这可能是临床改善骨关节炎严重程度的一种新策略。

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MSCs外泌体在皮肤损伤修复中的作用及机制

皮肤组织的再生需要皮肤细胞、细胞外基质、血管和神经等的协调作用，MSCs外泌体通过参与皮肤再生的过程，而在皮肤损伤后的再生中发挥着重要作用。He等发现MSCs外泌体通过转移miR-223靶向伤口部位巨噬细胞pknox1基因，诱导巨噬细胞向M2表型极化，使特异性因子RELM-α和精氨酸酶1的表达增加，炎症介质IL-10表达水平升高，TNF-α表达水平降低，加速皮肤创面愈合。Li等发现MSCs外泌体通过将长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)H19转移至成纤维细胞，通过microRNA-152-3p上调癌基因PTEN表达，促进成纤维细胞增殖和迁移，抑制细胞凋亡和炎症反应，加速糖尿病足皮肤溃疡的愈合。Fang等发现脐带来源的MSCs外泌体通过microRNAs(miR-21，miR-23a，miR-125b，and miR-145)抑制TGFα2/SMAD2通路抑制α平滑肌肌动蛋白和胶原的沉积，减轻成纤维细胞分化聚集引起的过度瘢痕，在皮肤创面愈合中发挥重要作用。

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MSCs外泌体在心肌损伤修复中的作用及机制

心肌细胞对缺氧刺激敏感，会发生代谢变化。细菌脂多糖可使心肌细胞低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)上调，还可诱导心肌细胞Caspase-3水平明显升高、凋亡增加。Kore等发现MSCs外泌体通过抑制LOX-1表达，进而抑制心肌细胞凋亡和自噬反应，促进心肌细胞存活，保护应激状态下的心肌细胞。Luther等对MSCs外泌体进行miRNA测序发现，在几种保护心脏的miRNA中，miR-21a-5p含量最丰富。MSCs外泌体通过增加受体心肌细胞中miR-21a-5p的水平，从而下调促凋亡基因PDCD4、PTEN、Peli1和FasL在心肌中的表达，也可能有助于血管生成、心肌细胞增殖，从而起到心脏保护作用。Zhao等发现心肌缺血再灌注损伤后，心肌内注射的MSCs外泌体通过miR-182靶向调节下游Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)，促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化，减少心肌梗死面积，减轻心脏炎症程度，保护心脏。

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MSCs外泌体在血液疾病中的作用及机制 大多数异基因造血干细胞移植后的患者术后会产生严重的并发症，比如感染、肝静脉闭塞病和GVHD等，而糖皮质激素难治性GVHD是影响移植患者预后的主要因素。Kordelas等发现MSCs外泌体治疗减少患者外周血单个核细胞和NK细胞的促炎性细胞因子IL-1α、TNF-α和IFN-α的分泌，减轻腹泻和口腔黏膜皮肤剥脱等临床症状，为GVHD治疗提供一种全新的无细胞化治疗方案。Xu等发现MSCs外泌体通过将PMSA3和PSMA3-AS1信号传递至骨髓瘤细胞中而增加蛋白酶体抑制剂硼替佐米的耐药性，干扰PSMA3-AS1基因的表达，将为阻止多发性骨髓瘤的进展提供依据。Liu等发现人脐带MSCs外泌体使伊马替尼诱导的K562细胞Bax表达升高和Bcl-2表达降低，进一步激活Caspase-9和Caspase-3，促进白血病细胞凋亡，Caspase抑制剂Z-VAD-FMK可以逆转此作用，结果表明MSCs外泌体增强了K562细胞对伊马替尼的敏感性。因此，MSCs外泌体治疗可能是一种有希望提高慢性粒细胞白血病疗效的方法。

4 结语

MSCs外泌体在促进关节软骨、皮肤组织损伤修复、抗肿瘤和减少心肌损伤等方面具有重要作用，其机制主要是通过水平转移蛋白、mRNA和miRNA等遗传物质至靶细胞中来发挥作用，但具体作用机制较复杂，仍需要进一步研究。如何通过靶向修饰MSCs外泌体，提高治疗的精准性和有效性仍有待探讨。随着未来研究的不断发展，MSCs外泌体应用前景广阔，其疗法将得到进一步推广。