木薯叶片5种防御酶活性与细菌性枯萎病抗性的关系

吴美艳 罗兴录,2* 刘珊廷 樊铸硼 黄堂伟 杨燕妮

(1.广西大学 农学院，南宁 530005；2.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁 530004)

木薯(Cassava)属于大戟科木薯属，与马铃薯和甘薯并列世界三大薯类作物。我国种植木薯的产区分布在热带地区。木薯块根不仅淀粉含量高，而且富含大量膳食纤维，可食用、饲用并用于工业开发。木薯细菌性枯萎病(Cassava bacterial blight,以下简称CBB)又称细菌性萎蔫病，是受地毯草黄单胞菌(

Xanthomonas

axonopodis

pv.

manihotis

)侵染木薯叶片、茎秆，出现萎蔫，甚至死亡的病害。该病害可使木薯减产12%～90%，严重制约了我国木薯产业的可持续发展。因此，亟待开展木薯抗细菌性枯萎病的研究，实现木薯的高产增收。

病原物侵入后植物，植物在组织结构、生理生化上产生一系列反应，其中参与各种代谢活动的防御酶活性变化最为活跃，防御酶活性变化情况与植物抗病性关系密切。PAL 是一种苯丙烷类代谢定速酶，也是苯丙烷类代谢途径起催化作用的关键酶和限速酶。POD和PPO参与植物体内酚类物质和木质素的合成，是植物体内活性氧清除系统的主要保护酶，二者协同作用可抵抗活性氧对植物细胞造成的伤害，与植物的抗病性有重要关系。SOD 作为植物体内活性氧清除系统重要保护酶之一，能清除超氧化物阴离子自由基，提高植物抗逆性。CAT 催化 HO分解为 HO和O，能清除植物体内过量的 HO，从而将 HO维持在正常水平。李伯凌等对细菌性枯萎病的研究表明木薯叶片接种后，叶片中的POD活性与木薯的抗病性呈正相关。樊春俊等研究木薯对细菌性枯萎病抗性与防御酶活性的关系，发现对细菌性枯萎病抗性不同的木薯品种的POD活性有差异。陈亮等在研究西瓜叶片与枯萎病之间的关系时发现高抗西瓜品种叶片的SOD、POD、PPO、CAT等酶活性较未接种显著增加。虽然针对植物感病后防御酶变化规律的研究的报道不少，但是对木薯感病后防御酶活性变化规律的研究尚少。因此，本试验拟以‘GR891’和‘新选048’为研究对象，采用喷雾法接种自然发病，根据病斑大小、病情分级等鉴定木薯抗病性，划分抗木薯细菌性枯萎病等级，分析健康和感病植株叶片5 种酶SOD、PAL、POD、CAT和PPO活性，同时比较2 种木薯品种的叶片酶活性与细菌性枯萎病的抗性关系，以期为控制该病害扩展蔓延提供生理生化方面的理论依据，旨在为‘GR891’和‘新选048’2 个木薯品种在实际应用生产中提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株为广西北海市合浦县农业科学研究所试验基地采集具有细菌性枯萎病症状的病叶，由广西大学农学院分离鉴定的Cax-03。

供试木薯品种分别为广西热带作物研究所培育的‘GR891’和广西大学木薯课题组培育的‘新选048’2个木薯品种。

1.2 接种及取样

于2018年3月广西大学农学院综合楼后试验地进行桶栽，每个大桶内种植2株木薯种茎，在8月份木薯的块根形成期选用分离出的Cax-03的菌株接种木薯叶片。

将菌株Cax-03的菌液在牛肉膏蛋白胨培养基平板上涂布，28 ℃倒置培养48 h，挑取一个单菌落放入150 mL的三角瓶，在130 r/min、28 ℃的摇床上摇12 h，配制成3.0×10CFU/mL(OD=0.6)菌悬浮液。选择生长良好、叶龄一致的完好复叶进行接种，主要采用木薯的第5片完全展开叶进行接种，以灭过菌的液体培养基为对照CK。CK1表示‘GR891’喷雾接种法灭过菌的液体培养基(对照组)、T1表示‘GR891’喷雾法接种Cax-03菌液(试验组)、CK2表示‘新选048’喷雾法接种灭过菌的液体培养基(对照组)、T2表示‘新选048’喷雾法接种Cax-03菌液(试验组)。接种完后用洁净干燥的塑料袋对接种叶片进行套袋保温保湿24 h。在接种后的第7天和第14天分别采集木薯中上部的功能叶片，混合后液氮速冻，于-80 ℃低温冰箱内储存备用，用于测定各酶活指标。

1.3 测定项目及方法

1

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3

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1

防御性酶活测定方法

PAL活性采用分光光度法测定；SOD活性采用氮蓝四唑光化还原法测定；POD活性采用愈创木酚比色法；PPO活性测定采用碘滴定法；CAT活性测定采用紫外吸收法。

1

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3

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2

木薯病情指数评估

本次试验对接种木薯的病情等级主要根据岑贞陆等和李伯凌等的方法来划分，具体划分标准如下：

0级：叶片无明显病斑，接种点没有发病

1级：在叶片上可看到有水渍状病斑，病斑长度<0.5 cm

3级：病斑长度0.6～1.5 cm

5级：病斑长度1.6～2.5 cm

7级：病斑长度2.6～4.0 cm

9级：叶片发病严重，叶片萎蔫或脱落，病斑长度>4.0 cm。

感病评价接种 12 d后测量病斑大小，病情指数计算公式如下：

病情指数

根据病情指数划分抗病水平：高抗在10以内；中抗20～30；感病30～40；中感40～60；高感60以上。

1.4 统计分析

用Microsoft Excel 2007软件进行原始数据整理、分析、作表、作图，用 SPSS 18.0 软件进行方差分析或其他统计分析。

2 结果与分析

2.1 2个木薯品种对细菌性枯萎病的抗性比较

对桶栽的‘GR891’和‘新选048’2个木薯品种进行喷雾法接种之后，调查木薯叶片的病情，结果见表1。可知：‘GR891’的病情等级为3级；‘新选048’病情等级为1级，‘GR891’比‘新选048’的病情指数高，‘GR891’的病情指数为43.7，表现为中感，‘新选048’的病情指数为29.4，表现为中抗。因此，‘新选048’对细菌性枯萎病的抗性更强。

表1 接种12 d 2个木薯品种的病情指数比较

Table 1 Comparison of disease index of 2 cassava varieties inoculated for 12 days

木薯品种Variety病斑长度/cmLesionlength病情指数DiseaseinfectedindexGR8910.6±0.2aA43.7新选048XX0480.3±0.1bB29.4

注：同列数据小写字母和大写字母分别表示‘GR891’和‘新选048’在<0.05和<0.01水平上差异显著。下同。

Note: Values marked with lowercase letters and uppercase letters within the same column indicate that the‘GR891’ and ‘Xinxuan048’are significantly different at the levels of <0.05 and <0.01, respectively.The same below.

2.2 侵染条件下木薯叶片防御酶活性的比较

2

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2

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1

PAL活性变化

不同品种发病叶片与健康叶片的PAL活性比较见表2。可知接种病原菌后，2个木薯品种之间存在着差异。接种第7天的对照CK1的PAL活性低于处理T1，处理T2的PAL活性低于CK1;接种第14天后，处理T1低于对照CK1，处理T2高于对照CK2。接种第2天到第14天，处理T1的PAL酶活性下降了30.17%，处理T2的PAL酶活性上升了6.54%。接种第7天，各处理间无明显差异；接种第14天后，对照CK1和处理T1之间差异极显著，对照CK2和处理T2无明显差异。

表2 不同品种发病叶片与健康叶片的PAL活性比较

Table 2 Comparison of PAL activity between diseased leaves and healthy leaves of different cultivars

处理Treatment第7天Day7第14天Day14CK111.75aA13.19aAT113.06aA9.12bBCK213.40aA12.39aAT212.57aA13.45aA

注：CK1，‘GR891’喷雾法接种灭过菌的液体培养基(对照组)；T1，‘GR891’喷雾法接种Cax-03菌液(试验组)；CK2，‘新选048’喷雾法接种灭过菌的液体培养基(对照组)；T2，新选048’喷雾法接种Cax-03菌液(试验组)。下同。

Note: CK1,‘GR891’ spray inoculation of sterilized liquid medium(control group); T1,‘GR891’ spray inoculation of Cax-03 bacterial liquid(test group); CK2,‘Xinxuan048’ spray inoculation of sterilized liquid medium(control group); T2, ‘Xinxuan048’ spray inoculation of Cax-03 bacterial liquid(test group).The same below.

2

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2

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2

SOD活性变化

不同品种发病叶片与健康叶片的SOD活性比较见表3。可知：接种细菌性枯萎病病原菌后，2 个木薯品种在叶片SOD活性无明显变化。在接种第7天，对照CK1和处理T1之间显著差异，对照CK2和处理T2之间差异显著；接种第7天和接种第14天，2个品种的对照CK与处理T之间都无显著差异。这说明，接种细菌性枯萎病病原菌后，对木薯叶片的SOD活性影响不大。

表3 不同品种发病叶片与健康叶片的SOD活性比较

Table 3 Comparison of SOD activity between diseased leaves and healthy leaves of different cultivars

处理Treatment第7天Day7第14天Day14CK1474.34aA470.11aAT1487.45aA465.68aACK2425.40bB506.54aAT2462.20aAB501.84aA

2

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2

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3

CAT活性变化

不同品种发病叶片与健康叶片的CAT活性比较见表4。可知：接种细菌性枯萎病病原菌14天后，2个木薯品种叶片的CAT活性都是随着时间的增加而增加，处理T2的CAT活性上升程度最明显。其中：处理T2的CAT酶活性比处理第7天时增加了72.31%；处理T1的CAT酶活性增加了34.2%;没有接种病原菌的对照CK变化不大。接种第7天，处理T1的CAT活性达到最高，为50.59 U/(g·min)，与其他3个处理之间差异极显著，CK2和T2差异显著;接种第14天，T1和CK1差异极显著，T2和CK2差异极显著，T1和T2差异极显著。

表4 不同品种发病叶片与健康叶片的CAT活性比较

Table 4 Comparison of CAT activity between diseased leaves and healthy leaves of different cultivars

处理Treatment第7天Day7第14天Day14CK129.24cC36.21cCT150.59aA76.90bBCK232.96cBC44.20cCT239.89bB144.10aA

2

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2

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4

PPO活性变化

不同品种发病叶片与健康叶片的PPO活性比较见表5。可知：接种病原菌14天后，处理T1的PPO活性增加幅度大于处理T2，处理T1增加了20.05%，处理T2增加了9.55%。在接种第7天，T2与CK1、CK2和T1之间差异极显著，CK1和T1之间差异显著；在接种第14天，CK1和T1之间差异显著，CK2和T2差异极显著，T1和T2无明显差异。

表5 不同品种发病叶片与健康叶片的PPO活性比较

Table 5 Comparison of PPO activity between diseased leaves and healthy leaves of different cultivars

处理Treatment第7天Day7第14天Day14CK12.45cB2.88bcABT12.71bB3.39abACK22.73bB2.48cCT23.22aA3.56aA

2

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2

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5

POD活性变化

不同品种发病叶片与健康叶片的POD活性比较见表6。可知：接种病原菌14天后，2 个木薯品种叶片的POD活性都明显的增加，‘新选048’叶片的POD活性增加幅度更大，比接种第7天增加了94.78%，T1的POD活性增加了91.63%。接种第7天，CK1和T1差异极显著，CK2和T2差异极显著，T1和T2无显著差异；接种第14天，发病的木薯叶片POD活性迅速升高，CK1和T1差异极显著，CK2和T2差异极显著，T1和T2差异极显著。

表6 不同品种发病叶片与健康叶片的POD活性比较

Table 6 Comparison of POD activity between diseased leaves and healthy leaves of different cultivars

处理Treatment第7天Day7第14天Day14CK134.23bB40.44cCT146.70aA558.25bBCK231.23bB43.13cCT253.33aA1010.62aA

2.3 木薯叶片细菌性枯萎病病情指数与各防御酶活性的相关性分析结果

病情指数与‘GR891’和‘新选048’植株5种酶活性相关性分析结果见表7。可知：病情指数与GR891植株的SOD酶活性中度负相关，与CAT酶活性关系极弱，与PPO酶活性高度负相关，与POD酶活性高度正相关，与PAL显著性负相关；病情指数与‘新选048’植株的SOD酶活性低度正相关，与PAL、CAT酶活性不相关，与PPO、POD酶活性显著性负相关。本次研究得出，‘新选048’防御性酶活性与病害关联性较小，而‘GR891’防御性酶活与病害有明显的相关性，也说明侵染细菌性枯萎病病原菌后能够引起不同木薯品种酶活性变化，且‘新选048’的抗性比‘GR891’强。

表7 病情指数与酶活性相关分析

Table 7 Correlation between disease index and enzyme activity

木薯品种VarietySODPALCATPPOPODGR891-0.513-0.983-0.379-0.8710.873新选048XX0480.407-0.3540.335-0.907-0.936

3 讨 论

木薯叶片受到细菌性枯萎病病原菌侵染后，生长受到抑制。本研究发现木薯叶片受到病原菌喷雾法侵染后，叶片由原来绿色然后退绿最后枯黄、萎蔫，发病后‘新选048’叶片的病斑面积比‘GR891’小，病斑长度也比‘GR891’的小，说明‘新选048’的抗病性比‘GR891’强。

宋瑞芳等在研究发现烟草抗病品种PAL活性高于感病品种；史芳芳等研究不同抗病品种的荷花接种腐烂病菌后发现POD、PPO活性与品种抗病性呈正相关关系，可能是因为抗病品种受病原菌侵染后生成的木质素比感病品种多，酶活性升高快。本研究发现接种Cax-03菌液后2 个品种的PAL活性出现了不一样的变化趋势。接种7 d时，‘GR891’的PAL活性高于对照；接种发病后，‘新选048’与抗性呈正相关，而‘GR891’与抗性负相关，说明受到侵害后，‘新选048’品种PAL活性升高合成木质素，阻止病原菌破坏细胞壁，而病原菌侵入后‘GR891’品种PAL活性降低，木质素合成减少，病原菌入侵增多。2 个品种接种病原菌后PAL出现不一致的变化规律，其与抗枯萎病的关系还需要进步研究。接种后‘新选048’的POD活性显著增高，呈极显著差异，说明‘新选048’抗性较强。PPO活性在接种发病后均呈升高趋势，GR891的PPO活性增长幅度大于新选048的PPO活性，但‘新选048’活性高于‘GR891’，说明PPO和抗病反应有一定关系。接种14 d后，2 个木薯品种的SOD活性变化无明显差异，说明SOD活性与植物抗病性之间的关联不大，这与吴超等研究香蕉枯萎病与防御酶活性之间的关系中得出的结论一致。刘学辉等对辣椒感染番茄斑萎病毒后，3 个辣椒品种CAT活性均增高，并且峰值出现在第14天；宋培玲等对油菜黑胫病菌防御酶活性和刘延硕等对人参锈腐病的研究表明CAT活性与其抗病性呈正相关性，与本试验研究结果一致。

4 结 论

本研究发现接种Cax-03菌液后，木薯品种‘GR891’发病更严重，病斑密度更大，病斑长度更长，病情指数高，病害侵染程度比‘新选048’重；‘新选048’品种叶片中CAT、PPO和POD活性均高于‘GR891’品种。因此，‘新选048’品种比‘GR891’品种抗病性更强。本研究可为早期鉴别细菌性枯萎病并筛选抗病木薯品种提供依据。