光谱滴定法在食品钙分析中的应用研究

吕萍萍 汪海波 关朝亮 何浩 宋喜臣 宋清超 张珗 桑琳 王飞

（1.绥芬河海关综合技术中心 黑龙江绥芬河 157399；2.秦皇岛海关技术中心）

1 前言

钙是人体必需的元素，是构成骨骼和牙齿的重要成分[1]，人体对钙的摄入主要通过食物和水，因此食品中钙含量的测定十分重要。当前，对食品中的钙进行测定的方法有很多，主要分为化学法和仪器法，常见方法有EDTA滴定法[2-3]、高锰酸钾滴定法[4]、分光光度法[5-6]、电感耦合等离子体质谱法[2-3]、离子色谱法[3]、火焰原子吸收法[2-3]、X射线荧光光谱法[3]、电感耦合等离子发射光谱法[2-3]、离子选择性电极浓度直读法[3]等。其中，EDTA滴定法因其技术成熟、成本低廉被广泛应用。

EDTA滴定法属于人工感官滴定，滴定终点需要用人眼对颜色的变化进行主观判断，存在色评价条件难以统一、对终点颜色的文字描述难以理解为感觉的颜色、终点颜色无法量值溯源等问题，给结果的判定带来诸多困扰。而且在实际的滴定过程中，滴定终点的颜色突变并不明显，对检测人员的技术和经验要求较高，容易产生误差。

可见光光谱滴定技术（Visible Spectral Titration Technology，VSTT）是2018年面世的新技术，通过化学反应过程中发生的光谱变化进行物质结构表征[7]，同时对滴定参数进行同步记录，实现滴定终点的量值溯源，可以有效实现滴定过程中颜色的数值化、图形化，避免颜色变化不明显、不同人员感官差异等因素所产生的颜色判断误差，其检出限更低。VSTT在食品中钙分析领域的应用尚未见报道，本文对光谱滴定法在食品中钙含量测定方面的应用进行验证，以期为相关人员提供参考。

2 材料与方法

2.1 材料

市售胡萝卜、葡萄。

2.2 仪器与试剂

光谱滴定仪（SX-Z-3.3，秦皇岛水熊科技有限公司）；电子天平（XP205，瑞士梅特勒公司）；电热板（HT300，中国广州分析测试中心）；恒温干燥箱（M53，德国宾德）；滴定管（25 mL）。

碳酸钙（99.99%，上海麦克林生化科技有限公司）；盐酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；硝酸（优级纯，德国默克公司）；高氯酸（优级纯，德国默克公司）；氧化镧（优级纯，天津市大茂化学试剂厂）；氢氧化钾（≥85%，美国阿法埃莎化学试剂）；硫化钠（分析纯，天津市光复精细化工研究所）；乙二酸四乙酸二钠（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；柠檬酸钠（分析纯，天津市光复科技发展有限公司）；钙羧酸指示剂（优级纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

2.3 方法

2.3.1 钙的光谱滴定原理

在滴定过程中，不同离子成分的改变会引起被测物结构的改变，同步使吸收光谱发生颜色变化，该变化点为国标的滴定终点。VSTT[7]用色变曲线参数同步描述颜色的变化轨迹，用数字化、图形化的曲线标识颜色的变化过程，曲线上的突变峰与吸收光谱具有对应关系。

2.3.2 光谱滴定仪条件

光谱范围：380 nm～780 nm，△λ5 nm；测量周期：100 ms；积分时间：100 ms；光程：10.0 mm；滴定速率：0.167 ml/min；搅拌速度：300 r/min，靴型反应器：180 mL。

2.3.3 光谱滴定方法

滴定度（T）的测定：在靴型反应器中依次加入：3.00 mL钙标准储备液、约80 mL去离子水、1滴浓度为10 g/L的硫化钠溶液、0.1 mL浓度为0.05 mol/L的柠檬酸钠溶液、5 mL浓度为3.75 mol/L的氢氧化钾溶液、3滴浓度为1g/L的钙羧酸指示剂，以约0.001 mol/L的EDTA溶液滴定。当选定的色变曲线出现峰值时，对应的加入试剂的体积为滴定终点值。计算每毫升EDTA溶液相当于钙的毫克数，即滴定度（T）[2]。公式（1）：

式中：Cca—钙标准储备液浓度；Vca—钙标准储备液使用体积；VEDTA—滴定钙消耗的EDTA体积。

样品的测定[2]：样品消解后，定容至25 ml，分别吸取1.00 mL试样消化液及空白液，置于靴型反应器中，以下同滴定度（T）的测定。公式（2）：

式中：X—样品中钙的含量；T—EDTA对钙的滴定度；V1—滴定样品消耗的EDTA体积；V0—滴定空白消耗的EDTA体积；V2—样品定容体积；V3—滴定取样体积。

2.3.4 感官滴定方法[2]

滴定度（T）的测定：吸取0.50 mL钙标准储备液，置于10 mL试管中，依次加入：1滴10 g/L硫化钠溶液、0.1 mL的0.05 moL/L柠檬酸钠溶液、1.5 mL的1.25 moL/L氢氧化钾溶液、3滴1 g/L羧酸指示剂，立即以约0.001 moL/L的EDTA溶液滴定，目视至溶液由紫红色变蓝色为滴定终点，记录所消耗的EDTA溶液的体积[2]，代入公式（1）进行计算。

2.4 统计学处理

应用SPSS 22.0软件对2种方法的测定结果进行配对样本t检验分析，推论出差异发生的概率P值（即sig值），比较2种方法有无差异，验证所得结论的统计学意义。

3 结果

3.1 钙的光谱滴定终点确认

钙的光谱滴定过程中，CIE1976（L*a*b*）均匀彩色空间参数值的明度指数L*值、红-绿色品指数a*值、黄-蓝色品指数b*值，均发生了相应改变，滴定终点时，各数值的变化明显减小，其变化轨迹见图1、图2、图3。

图1 钙的光谱滴定CIE1976（L*a*b*）曲线V-L*

图2 钙的光谱滴定CIE1976（L*a*b*）曲线V-a*b*

图3 CIE 1976（L*a*b*）彩色均匀空间示意图[7]

从图中可以看出，L*值变化不大，在x轴上方，说明溶液的明暗度无明显变化；L*值曲线不平滑，有干扰峰，可能是由于在滴定过程中产生少量沉淀，影响了透光度。a*值明显减小，由x轴上方下降至x轴下方，说明溶液颜色由红色向蓝绿色转变；在接近终点时变化趋于平缓，曲线平滑，无干扰峰。b*值由x轴附近下降至x轴下方，说明溶液颜色由淡蓝色变为蓝色；在接近终点时变化趋于平缓，曲线平滑，无干扰峰。试验溶液变化为混合色，即溶液由红色和淡蓝色的混合色紫红色，转变为蓝绿色和蓝色的混合色蓝色。由此可见，光谱滴定颜色的测定数据与传统感官滴定人工判断颜色的变化相符。

本文采用VSTT的参数△a*3/△V3峰值做为滴定终点[7]，更接近a*值和b*值的共同变色终点。以加入滴定剂的体积（V）作为横坐标，以光谱滴定参数△a*3/△V3作为纵坐标，绘制△a*3/△V3-V滴定曲线，曲线上的最大峰值即为滴定终点，见图4。

图4 钙的光谱滴定CIE1976（L*a*b*）曲线△a*3/△V3-V

3.2 滴定度（T）的测定结果比对

化学反应方程式EDTA与钙发生化学反应的摩尔配比为1：1，即理论上滴定1 moL钙需消耗1 moL EDTA。本文配制的钙标准储备液浓度为103.04 mg/L（钙的摩尔浓度为40.08 g/moL），相当于0.002 580 moL/L，滴定用EDTA标定浓度为0.001 068 moL/L，理论上滴定0.50 mL钙需要消耗1.21 mL EDTA溶液可到达滴定终点，滴定3.00 mL钙则需要消耗7.25 mL EDTA溶液可到达滴定终点，理论滴定度（T）为0.042 6 mg/mL。

在相同条件下，2名研究人员分别利用感官滴定法和光谱滴定法测定EDTA对钙的滴定度，2种方法测定的数据比对详见表1。

表1 钙的滴定度（T）测定结果

从表1可以看出：1.2名研究人员用感官滴定测定钙的滴定度（T）结果均值分别为0.046 1、0.045 3，存在差异；2名研究人员用光谱滴定法测定钙的滴定度（T）结果均值均为0.041 9，无差异。2.与感官滴定法比较，光谱滴定法测定钙的滴定度（T）值为0.042 1更接近理论值0.042 6。3.与感官滴定法相比，光谱滴定法的精密度更好。

对2名研究人员分别利用感官滴定法和光谱滴定法检测的结果进行配对样本t检验，详见表2。

表2 钙的滴定度t检验

t检验结果显示，同一人员用不同方法测定时，检测结果均具有显著性差异（P＜0.05）；不同人员用相同方法测定时，结果均无显著性差异（P＞0.05）；不同人员用光谱滴定法测定结果的差异性小于感官滴定法（P1.000＞P0.267）。

以上数据说明，在测定钙的滴定度（T）时，光谱滴定法的测定结果优于感官滴定法，感官滴定法的操作过程对结果值的影响更大，这是由于感官滴定依赖人眼主观判断，而人眼对颜色的感应是不一致的。光谱滴定法对颜色的判断依据客观的参数计算，其判定条件更稳定。可见光谱滴定法的优势明显，由该法代替人工滴定法测定钙的滴定度具有可行性。

3.3 样品的测定结果比对

在相同的前处理条件下，利用感官滴定法和光谱滴定法测定样品中钙的含量，同时进行样品加标回收率试验，验证2种方法的可靠性，详见表3、表4。

表3 样品中钙含量的测定结果及t检验

表4 回收率的测定结果

由表3和表4可知，2种方法测定样品中钙含量结果的精密度均符合GB 5009.92-2016的要求（≤10%）[2]；2种方法测定样品中钙含量的结果均无显著差异（P＞0.05）；感官滴定法的加标回收率为96.7%～105.1%，光谱滴定法的加标回收率为92.6%～99.7%，基本符合GB/T 27404-2008中的技术要求（被测组分含量＞100 mg/kg时，回收率范围为95%～105%）[8]，表明2种方法均准确、可靠。

3.4 光谱滴定法测定钙的检出限

本次测定重复11次空白试验[9]，测定结果按公式（2）计算为样品中的钙含量，结果见表5，并按公式（3）计算方法检出限。

表5 光谱滴定法测定钙含量的检出限（n=11）

式中：MDL—方法检出限；n—样品的平行测定次数；t—自由度为n-1，置信度为99%时的t分布值（单侧）；S—n次平行测定的标准偏差[9]。

本次测定t（10，0.99）值为2.764，以此计算得到，本方法的检出限为25.3 mg/kg，最大差异值为28.8，在允许的差异范围40.7±12.7之内，符合HJ 168—2020标准中“检出限可允许的差异范围应在‘空白试验测定值的均值估计检出限的1/2’以内”的要求[9-10]。光谱滴定法测定食品中钙的检出限（25.3 mg/kg）小于国标GB 5009.92中EDTA滴定法的检出限（100 mg/kg）。

4 结论

可见光光谱滴定技术（VSTT）是由我国学者于2018年首次提出的滴定分析理论，实现了有色滴定分析的数字化、图形化和自动化，是滴定分析领域的新突破。目前，光谱滴定法的应用研究还处于空白阶段，本文首次利用光谱滴定法测定食品中的钙，通过精密度、准确性、检出限等指标验证了方法的可行性，证明了光谱滴定可代替感官滴定的可操作性，为VSTT的应用研究提供了有价值的参考，VSTT的进一步发展或将成为解决化学研究、检验检测等行业问题的新技术手段。