阴道壁组织中TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表达在盆底功能障碍患者中的临床意义

汪新宇 程永玲 刘晓宁 管晓卿

盆底功能障碍（pelvic floor dysfunction，PFD）是由于各种病因导致盆底支持组织变得薄弱，使盆腔脏器发生移位，从而导致盆腔器官的位置和功能出现异常，主要包括子宫脱垂及阴道前后壁松弛等盆腔器官脱垂（Pelvic organ prolapse，POP）及压力性尿失禁（Stress urinary incontinence，SUI），该疾病的发生与支撑盆腔器官的阴道和盆底组织机械功能减退有关。目前认为，细胞外基质的胶原蛋白的变化可导致盆底支持组织损伤，破坏盆底完整结构，从而导致PFD 的发生［1］。相关研究指出，转化生长因子-β1（Transforming Growth factor-β1，TGF-β1）、基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinase 9，MMP-9）表达与细胞外基质结构的完整性相关［2］。亦有报道发现，TGF-β1 与胶原蛋白的生成和降解有关［3］。TGF-β1 是一组具有多种功能的蛋白多肽，是细胞外基质的一类生物活性分子，在骨组织和血小板中含量最为丰富，可调节胶原代谢，促进胶原、纤维蛋白的表达，抑制细胞外基质膜的分解，进而影响PFD 的发生发展过程；而MMP-9 可直接影响局部组织中多种类型胶原蛋白的生成、结构和功能，可降解细胞外基质膜的有效成分、调节细胞黏度而抑制PFD 患者的盆地组织正常功能。核因子E-2 相关因子2（nuclear factor E-2 related factor，NrF 2）是一类细胞核转录因子家族蛋白，目前对于其与PFD 发生的关系尚无定论。故本研究通过分析PFD 患者阴道壁组织中TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表达，旨在探究其与PFD的发生发展的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2019年3月至2021年7月于涿州市医院就诊的92 例PFD 患者为研究对象，根据疾病类型将其分为POP 组（35 例）、SUI 组（31 例）及POP 合并SUI 组（26 例），并以47 例健康妇科检查者为对照组。POP 组：平均年龄（39.87±4.05）岁，平均孕次（2.25±0.34），平均产次（1.71±0.30）次，绝经7 例。SUI 组：平均年龄（38.64±4.21）岁，平均孕次（2.15±0.37）次，平均产次（1.72±0.25）次，绝经9 例。POP 合并SUI 组：平均年龄（39.09±4.17）岁，平均孕次（2.19±0.31）次，平均产次（1.75±0.28）次，绝经5例。对照组：平均年龄（40.05±4.73）岁，平均孕次（2.21±0.35）次，平均产次（1.79±0.25）次，绝经10 例。纳入标准：①符合有关PFD 的诊断标准［4］；②存在尿失禁、慢性盆腔疼痛者；③临床资料完整者。排除标准：①合并严重心肝肾功能异常者；②既往有盆腔手术史者；③合并严重妇科疾病患者；④合并恶性肿瘤疾病患者；⑤妊娠期妇女；⑥盆腔神经损伤者。本研究经院伦理委员会批准同意，研究对象均知情同意。

1.2 方法

①标本采集：于患者盆底手术中在膀胱颈与尿道连接处旁开1.5 cm 处，留取阴道前壁组织约1 cm3，用生理盐水充分洗净后，放入高压灭菌的Eppendorf 管后立即置入液氮中保存。②总RNA提取及逆转录：应用大连宝生物工程有限公司RNAiso Reagent 试剂盒进行总RNA 提取，并逆转录合成cDNA。③PCR 反应：TGF-β 1、MMP-9、Nrf 2基因的PCR 引物采用Primer5.0 引物软件设计［TGF-β1引物序列：上游：5′-ACCCACAAGGAAA TCTATGACA-3′，下游：5′-GCTGAGGTATCGTTAGGAAT-3′；MMP-9引物序列：上游：5′-TCCCTGGAGACCTGAGAACC-3′，下游：5′-CGGGAAGT CTTCCGAGTAGTTT-3′；Nrf 2引物序列：上游：5′-GTCGACATGAAGCACCTGAAGCGG-3′，下游：5′-GGATCCCTTTCTCTTTCCCTTTTG-3′］，并用GenBank Blast 进行同源性比对，引物序列由奥科生物科技有限公司合成。④产物鉴定：取6 μL PCR 产物，进行凝胶电泳，经GelDolXR 凝胶成像及Quantity one 分析系统进行图像分析，以β-actin为内参物，测定TGF-β1、MMP-9、Nrf 2和β-actin的平均积分光密度，以其与β-actin的比值表示其表达相对水平。

严重程度分组：参照Cullen PK Jr 等［5］方法及《女性压力性尿失禁诊断和治疗指南（2017）》［6］将SUI 分为Ⅰ～Ⅳ度。根据《妇产科学》第6 版［4］中关于POP 标准将POP 患者分为Ⅰ～Ⅲ度。

1.3 统计学处理

采用SPSS 25.0 软件进行数据处理；计数资料以%表示，采用χ2检验；计量资料经正态检验后用（）表示，用t检验比较两组间差异，用单因素方差分析比较多组间差异；采用ROC 曲线分析TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表达量对POP、SUI 的鉴别价值；采用spearman 检验分析TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表达量与POP、SUI 严重程度的相关性。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组及对照组TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表达比较

POP 合并SUI 组的TGF-β1表达量低于POP组、SUI 组，MMP-9、Nrf 2表达量高于POP 组、SUI组，差异有统计学意义（P均＜0.05）；POP 组、SUI组、POP 合并SUI 组的TGF-β1表达量低于对照组，MMP-9、Nrf 2表达量高于对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表1。

表1 四组患者的TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表达比较（±s）Table 1 Comparison of TGF-β1，MMP-9 and Nrf 2 among the four groups（±s）

表1 四组患者的TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表达比较（±s）Table 1 Comparison of TGF-β1，MMP-9 and Nrf 2 among the four groups（±s）

注：与POP 合并SUI 组比较，aP＜0.05；与对照组比较，bP＜0.05。

Nrf2 0.31±0.05ab 0.34±0.06ab 0.42±0.07b 0.15±0.03 182.27＜0.001组别POP 组SUI 组POP 合并SUI 组对照组F 值P 值n 35 31 26 47 TGF-β1 0.31±0.04ab 0.29±0.05ab 0.22±0.06b 0.40±0.08 51.857＜0.001 MMP-9 0.27±0.05ab 0.31±0.05ab 0.43±0.06b 0.09±0.02 363.929＜0.001

2.2 TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表达对POP 及SUI 的鉴别价值

TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表达单独检测及联合检测鉴别POP 及SUI 的AUC 分别为0.629、0.637、0.653、0.665。见表2、图1。

表2 TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表达对POP 及SUI 的鉴别价值Table 2 The differential value of TGF-β1，MMP-9 and Nrf 2 for POP and SUI

图1 ROC 曲线Figure 1 ROC curves

2.3 不同严重程度POP 及SUI 患者的TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表达比较

TGF-β1表达随POP、SUI 病情的加重而降低，MMP-9、Nrf 2表达随POP、SUI 病情的加重而增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 不同严重程度POP 及SUI 患者的TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表达比较（±s）Table 3 Comparison of TGF-β1，MMP-9 and Nrf 2 in patients with different severity of POP and SUI（±s）

表3 不同严重程度POP 及SUI 患者的TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表达比较（±s）Table 3 Comparison of TGF-β1，MMP-9 and Nrf 2 in patients with different severity of POP and SUI（±s）

组别POP nⅠ度Ⅱ度Ⅲ度F 值P 值Ⅰ度Ⅱ度Ⅲ～Ⅳ度F 值P 值23 21 17 SUI 17 26 14 TGF-β1 0.31±0.06 0.28±0.06 0.21±0.05 15.936＜0.001 0.28±0.04 0.26±0.05 0.23±0.04 5.048＜0.05 MMP-9 0.27±0.05 0.34±0.06 0.43±0.08 33.278＜0.001 0.31±0.05 0.35±0.06 0.46±0.06 29.600＜0.001 Nrf 2 0.32±0.05 0.36±0.05 0.40±0.07 10.486＜0.001 0.33±0.06 0.37±0.07 0.45±0.08 12.275＜0.001

2.4 TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表达与POP、SUI 严重程度的相关性分析

TGF-β1表达与POP、SUI 严重程度呈负相关，MMP-9、Nrf 2表达与POP、SUI 严重程度呈正相关。见表4。

表4 TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表达与POP、SUI 严重程度的相关性分析Table 4 Correlation between TGF-β1，MMP-9，Nrf 2 and the severity of POP and SUI

3 讨论

PFD 又称为盆地缺陷或盆底支持组织松弛，好发于中老年妇女，会给患者带来一系列精神、生理方面的困扰，严重影响其生存质量［7］。据统计显示，老年妇女的PFD 患病率高达50%，是影响中老年女性身心健康的主要疾病［8］。目前认为，盆底结缔组织结构及功能与PFD 的发生发展过程密切相关。胶原蛋白是盆底支持组织细胞外基质的主要成分，细胞外基质降解可导致盆底支持组织胶原蛋白含量减少，使得支持组织弹性兼容，而造成盆底结构损伤、松弛，最终导致PFD［9］。相关报道指出，MMP 相关因子与弹性蛋白、胶原蛋白相关，参与了细胞外基质的重构过程［10］。MMP-9 是MMP家族成员之一，具有蛋白水解功能，其可分解细胞外基质，可降解胶原、改变胶原蛋白的形状，可降解细胞外基质的所有成分，破坏细胞外基质正常结构和功能。分娩、产伤等因素使得女性盆底结缔组织受损后，可促进MMP-9 分泌，影响细胞外基质的合成及降解，进而导致盆底结构改变。TGF-β1是一种多功能生长因子，可调节细胞生长分化，抑制炎症。相关研究指出，TGF-β1 能刺激细胞及细胞外基质中大多数胶原基因的表达，并能促进胶原蛋白产物分泌［11］。NrF 2 可通过参与细胞内的氧化应激反应来控制细胞周期，目前临床上有关其与PFD 发生过程的报道较少。本研究表明PFD患者存在MMP-9、Nrf 2异常表达现象，且POP 患者合并SUI 可促进MMP-9、Nrf 2分泌，抑制TGF-β1表达，其原因目前尚不可知，故后期需进行进一步探究。POP 及SUI 是两种不同的PFD 类型，治疗方法也存在差异。POP 是指盆腔器官疝出至阴道壁及超出阴道壁，主要采用阴道子宫托及修补手术治疗；SUI 是一种常见疾病，表现为尿液不自主流出，目前尚无有效药物治疗方案，主要通过盆底肌肉锻炼、膀胱训练等进行治疗。本研究发现，TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表达鉴别POP 及SUI 的AUC 均小于0.7，表明其对POP、SUI 的鉴别价值较低，故不建议通过检测TGF-β1等来鉴别不同类型PFD。

盆底结缔组织细胞外基质的主要成分为胶原蛋白、弹性蛋白等，有助于维持正常盆地结构［12］。在正常生理条件下，成纤维细胞释放的纤维蛋白原及其溶解处于平衡状态，但在病理状态下，TGF-β1可刺激细胞外基质合成，诱导纤维酶活化因子抑制因子及胶原酶的合成释放，进而抑制胶原降解［13］。TGF-β1 对胶原的调控机制较为复杂，可通过自分泌调控方式及细胞因子的网络调控，间接调控胶原胶原相关基因的转录、翻译水平，并能维持相关蛋白质稳定性［14-15］。临床资料显示，MMP-9 与细胞外基质的合成及降解代谢有关，而盆底结缔组织一旦受到损伤或炎症刺激，其所产生的细胞炎性因子即能激活MMP-9，而影响结缔组织细胞外基质的重建和修复［16-17］。本研究结果提示POP、SUI 患者TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表达或与病情严重程度相关，经进一步分析发现，TGF-β1表达与POP、SUI 严重程度呈负相关，MMP-9、Nrf 2表达与POP、SUI 严重程度呈正相关，表明TGF-β1、MMP-9、Nrf 2或参与了PFD 的发生发展过程，其原因TGF-β1 水平降低可促进MMP表达，从而抑制阴道胶原合成，进而可加重病情。

综上所述，PFD 患者阴道壁组织TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表达与病情严重程度相关，且不同类型患者TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表达水平不同，但其对PFD 患者类型鉴别价值较低。但本研究尚存在不足之处，纳入样本量较少且为回顾性分析，可能会影响研究结果的准确性，故后期需增加样本量，并进行前瞻性研究，排除其他因素对本研究的影响，以减少研究过程中的误差，提高研究结果的可靠性。